| 1 |
1
분석 대상 세포를 배양하여 단일 세포층을 형성하는 단계;상기 단일 세포층을 시료에 노출시켜 세포 사멸 반응을 유도하는 단계;상기 세포 사멸 반응이 유도된 단일 세포층에 흡광염료를 주입하고 결정형성 또는 세포 염색을 유도하는 단계; 상기 흡광염료를 이용한 결정형성 또는 세포염색이 이루어진 단일 세포층을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하는 단계; 및상기 추출된 세포사멸 인자의 변수분석을 하여 세포사멸 기전(Mechanism) 및 세포사멸 정도를 촬영된 이미지로부터 각 세포가 차지하는 면적(area) 및 원형성(Circularity)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태인자값 또는 흡광인자로서 세포별 평균 흡광도(Mean Absorbance) 및 세포별 총 흡광도(Integrated Absorbance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포별 흡광도를 분석하여 정량화하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법
|
| 2 |
2
제1항에 있어서, 상기 분석 대상 세포의 단일 세포층은 미세유체 세포칩, 멀티 웰 또는 슬라이드 글라스에 형성되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법
|
| 3 |
3
제2항에 있어서, 상기 단일 세포층은 배지주입구, 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구, 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간, 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩에 분석 대상 세포를 배양하여 형성하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법
|
| 4 |
4
제1항에 있어서, 상기 흡광염료로는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypan blue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법
|
| 5 |
5
제4항에 있어서, 상기 단일 세포층의 촬영은광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라: 단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치: 및상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 세포 영상 분석 장치를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법
|
| 6 |
6
제5항에 있어서,상기 흡광염료로서 MTT를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 550nm ± 60nm의 파장영역이고, MTS 포마잔을 흡광염료로 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 490nm ± 60nm의 파장영역이며, 트립판 블루를 흡광염료로서 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 590nm ± 80nm의 파장영역인 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법
|
| 7 |
7
제4항에 있어서, 상기 흡광염료로서 MTT를 사용하는 경우 산화·환원반응에 의한 포마잔(formazan) 결정의 형성을 유도하기 위한 최적 시간을 10 ~ 240 분으로 부여하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법
|
| 8 |
8
제1항에 있어서,상기 세포별 흡광인자로서 세포별 흡광도의 추출은 영상획득 구성요소를 구비한 현미경에서 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하기 위해 촬영된 이미지를 영상분석 프로그램에서 분석하고, 분석되어 선택된 각각의 세포는 원본 이미지에서 신호 (I)를 이미지의 세포를 포함하지 않은 배경영역의 신호값 (I0)으로 나눈 뒤 로그값을 취해 흡광도로 변환시킨 이미지에 덮어져 촬영된 이미지 내의 각 세포별 흡광도를 추출하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법
|
| 9 |
9
삭제
|
| 10 |
10
제1항에 있어서, 세포사멸 정도를 정량화 하는 단계에서 이미지 분석을 통해 얻어진 세포별 흡광도를 포함하는 변수들을 다중 변수 분석하여 용량-반응 곡선을 얻고 세포 사멸 진행 정도의 정량화를 실시하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량분석법
|
| 11 |
11
광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라: 단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치; 및상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램;을 포함하는 세포사멸 정량분석을 위한 세포 영상 분석 시스템
|
