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1
5'에서 3' 방향으로 제1 인접(flanking) 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 및 제2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 세포의 유전체는 5'에서 3' 방향으로 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역 및 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것이고,상기 제1 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 5' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고
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2
청구항 1에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역, 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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3
청구항 2에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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| 4 |
4
청구항 3에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제8 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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5
청구항 4에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제4 표적 서열은 상기 제4 표적 서열의 3' 말단 영역과 상기 제4 표적 서열의 5' 말단 영역을 포함하는 것이고,상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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6
청구항 1에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator), 사일렌서(silencer), 또는 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법
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| 7 |
7
청구항 1에 있어서, 상기 표지자는 막 단백질, 당분해 대사 관련 단백질, DNA 생합성 관련 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 방법
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| 8 |
8
청구항 7에 있어서, 상기 막 단백질은 TolC(TolC outer membrane channel) 단백질인 것인 방법
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9
청구항 7에 있어서, 상기 당분해 대사 관련 단백질은 GalK(galactokinase) 단백질 또는 MalK(Component of malotse ABC transporter) 단백질인 것인 방법
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10
청구항 7에 있어서, 상기 DNA 생합성 관련 단백질은 ThyA(Thymidylate synthase) 단백질인 것인 방법
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11
청구항 1에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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12
청구항 2에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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13
청구항 3에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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14
5'에서 3' 방향으로 제1 인접 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역, 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역제3 영역2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제1 인접 서열 및 제2 인접 서열은 세포의 유전체의 삽입 부위의 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드 또는 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 포함하는, 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법
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15
청구항 14에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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16
청구항 15에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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17
청구항 16에 있어서,5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고, 상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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18
청구항 17에 있어서, 5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제8 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제4 표적 서열은 상기 제4 표적 서열의 3' 말단 영역과 상기 제4 표적 서열의 5' 말단 영역을 포함하는 것이고,상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법
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청구항 14에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator), 사일렌서(silencer), 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법
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청구항 14에 있어서, 상기 표지자는 막 단백질, 당분해 대사 관련 단백질, DNA 생합성 관련 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 방법
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청구항 20에 있어서, 상기 막 단백질은 TolC(TolC outer membrane channel) 단백질인 것인 방법
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청구항 20에 있어서, 상기 당분해 대사 관련 단백질은 GalK(galactokinase) 단백질 또는 MalK(Component of malotse ABC transporter) 단백질인 것인 방법
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청구항 20에 있어서, 상기 DNA 생합성 관련 단백질은 ThyA(Thymidylate synthase) 단백질인 것인 방법
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청구항 14에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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청구항 15에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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청구항 16에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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