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세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼, 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법(Hydrogel-in-oil emulsion containing cell, method for in vitro compartmentalization and ultra-high throughput screening of novel enzyme)

  • 기술번호 : KST2015230859
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요약 본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening; uHTS)에 관한 것이다. 하이드로겔 내에서 세포와 기질 사이의 반응 산물의 확산을 방지하여 형광강도가 강하므로, FACS 분석에 매우 유용하게 사용될 수 있다.또한, 본 발명의 세포외 구획화(IVC) 방법에 따른 에멀젼은 안정하여 장기 보관이 가능하고, 세포의 배양이 가능하여 단일 세포로부터 2~3개의 세포로 증식할 수 있는 이점이 있다.
Int. CL G01N 33/50 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) C12Q 1/25 (2006.01)
CPC
출원번호/일자 1020140072359 (2014.06.13)
출원인 한국생명공학연구원
등록번호/일자 10-1663556-0000 (2016.09.30)
공개번호/일자 10-2015-0143177 (2015.12.23) 문서열기
공고번호/일자 (20161007) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2014.06.13)
심사청구항수 9

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 송재준 대한민국 대전광역시 유성구
2 최종현 대한민국 대전광역시 유성구
3 고경철 대한민국 대전광역시 유성구
4 이빛나 대한민국 대전광역시 유성구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 최규환 대한민국 대전광역시 서구 한밭대로 ***, **층 그린국제특허법률사무소 (둔산동)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대전광역시 유성구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application
2014.06.13 수리 (Accepted) 1-1-2014-0555337-18
2 선행기술조사의뢰서
Request for Prior Art Search
2015.01.15 수리 (Accepted) 9-1-9999-9999999-89
3 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information
2015.02.05 수리 (Accepted) 4-1-2015-0007152-08
4 선행기술조사보고서
Report of Prior Art Search
2015.03.13 수리 (Accepted) 9-1-2015-0019112-13
5 의견제출통지서
Notification of reason for refusal
2015.10.21 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2015-0724471-29
6 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)
2015.12.21 수리 (Accepted) 1-1-2015-1247819-91
7 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)
2016.01.20 수리 (Accepted) 1-1-2016-0062313-73
8 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)
2016.02.22 수리 (Accepted) 1-1-2016-0170817-27
9 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment
2016.03.21 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2016-0271401-39
10 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)
2016.03.21 수리 (Accepted) 1-1-2016-0271416-13
11 거절결정서
Decision to Refuse a Patent
2016.07.13 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0504865-45
12 [법정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Extension of Legal Period] Request for Extension of Period (Reduction, Expiry Reconsideration)
2016.08.03 수리 (Accepted) 7-1-2016-0046581-12
13 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)
2016.09.12 수리 (Accepted) 1-1-2016-0891116-07
14 [명세서등 보정]보정서(재심사)
Amendment to Description, etc(Reexamination)
2016.09.12 보정승인 (Acceptance of amendment) 1-1-2016-0891101-12
15 등록결정서
Decision to Grant Registration
2016.09.29 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0703715-73
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번호 청구항
1 1
(a) 아가로오스(agarose) 또는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate: PEGDA)을 포함하는 액체배지를 제조하는 단계;(b) 상기 제조된 액체배지를 세포에 첨가하여 현탁액을 형성시키는 단계;(c) 상기 단계 (b)의 현탁액을 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture)에 첨가하는 단계; 및(d) 8,000 내지 13,500rpm으로 30 내지 180초 동안 균질화 하고, 겔(gel)화 하여 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔(hydrogel-in-oil) 에멀젼을 형성하는 단계;를 포함하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법
2 2
제1항에 있어서, 상기 단계 (d) 이후에, 에멀젼에 함유된 세포를 30 내지 37℃에서 1 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 구획화 (in vitro compartmentalization; IVC) 방법
3 3
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 기질을 더 첨가하여 현탁액을 형성하는 것을 특징으로 하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법
4 4
삭제
5 5
제1항에 있어서, 상기 아가로오스는 2 내지 4%(w/v) 저융점 아가로오스 (low melting agarose)인 것을 특징으로 하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법
6 6
삭제
7 7
삭제
8 8
제1항에 있어서, 상기 세포는 대장균 (E
9 9
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포외 구획화(IVC) 방법으로 제조된 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsion)
10 10
삭제
11 11
(a) 제9항에 따른 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼에 기질을 첨가하는 단계; (b) 상기 단계(a)에서 첨가된 기질과 하이드로겔 내의 단일세포에 포함된 효소가 반응하는 단계; 및(c) 상기 단계(b)의 반응 결과를 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 방법으로 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규효소 초고속 스크리닝 방법
12 12
제11항에 있어서, 상기 단계(a) 이전에 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsion)으로부터 오일 막을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신규효소 초고속 스크리닝 방법
13 13
제12항에 있어서, 상기 오일 막의 제거는 미네랄 오일(mineral oil), 헥산(hexane) 및 2-프로판올(2-propanol) 중에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 신규 효소 초고속 스크리닝 방법
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순번 연구부처 주관기관 연구사업 연구과제
1 미래창조과학부 한국생명공학연구원 주요사업(연구개발과제) 고기능 미생물오일 생산 바이오리파이너리 요소기술개발
2 교육과학기술부 한국생명연구원 원천기술개발 사업 HTS 로봇 시스템을 활용한 초고속 효소 탐색 기반 기술 개발