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메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법

  • 기술번호 : KST2014042186
  • 담당센터 : 대전기술혁신센터
  • 전화번호 : 042-610-2279
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 페놀계 화합물을 감지하는 재설계 유전자회로를 이용하여 메타게놈 유래 미량 활성을 탐색하여, 목적효소 유전자를 확보하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메타게놈 라이브러리 유래 목적효소의 탐색 방법을 이용하면, 자연환경에서 목적하는 효소활성을 단일세포 수준에서 초고속(million/day)으로 탐색 및 회수할 수 있다. 뿐만 아니라, 페놀유도체에 대한 민감도와 발현조절을 이용하여 효소개량을 위한 단백질 공학기술에도 적용할 수 있다. 페놀계 화합물, 메타게놈, 고속탐색
Int. CL C12N 1/21 (2006.01) C12Q 1/34 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 15/55 (2006.01)
CPC C12N 15/1086(2013.01) C12N 15/1086(2013.01)
출원번호/일자 1020090130204 (2009.12.23)
출원인 한국생명공학연구원
등록번호/일자 10-1128080-0000 (2012.03.12)
공개번호/일자 10-2011-0073049 (2011.06.29) 문서열기
공고번호/일자 (20120329) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 소멸
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2009.12.23)
심사청구항수 19

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 이승구 대한민국 대전광역시 유성구
2 최수림 대한민국 대전광역시 서구
3 나유진 대한민국 대전광역시 유성구
4 송재준 대한민국 대전광역시 서구
5 최종현 대한민국 대전광역시 유성구
6 김희식 대한민국 경기도 화성시

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 이처영 대한민국 서울특별시 강남구 언주로 ***, **층 (역삼동, 윤익빌딩)(*T국제특허법률사무소)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대전광역시 유성구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2009.12.23 수리 (Accepted) 1-1-2009-0799095-57
2 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2011.07.04 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2011-0372342-98
3 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2011.09.02 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2011-0689305-18
4 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2011.09.02 수리 (Accepted) 1-1-2011-0689306-53
5 등록결정서
Decision to grant		 2012.03.07 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2012-0134126-51
6 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2015.02.05 수리 (Accepted) 4-1-2015-0007152-08
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번호 청구항
1 1
다음 단계를 포함하는, 환경시료로부터 직접 순수분리한 유전체 또는 유전자를 포함하는 라이브러리인 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색방법:(a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 제공하는 단계; (c) 상기 메타게놈 라이브러리와 재설계 유전자회로를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물 라이브러리를 제작하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및(f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계
2 2
다음 단계를 포함하는, 환경시료로부터 직접 순수분리한 유전체 또는 유전자를 포함하는 라이브러리인 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색방법:(a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물을 제공하는 단계; (c) 상기 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계; (d) 상기 재조합 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및(f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계
3 3
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메타게놈 라이브러리가 플라스미드, 포스미드, 코스미드, BAC(bacterial artificial chromosome;박테리아 인조 염색체) 및 YAC(yeast artificial chromosome, 효모 인조 염색체)로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 토양으로부터 얻은 DNA를 도입하여 제작된 것을 특징으로 하는 방법
4 4
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 부위는 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자가 발현될 수 있도록 리포터유전자의 프로모터를 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법
5 5
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 셀룰라제, 글리코실세라미다제, 포스파아타제, 피타제, 에스터라제, 리파제, 유레타나제, 아미다제, 펩티다제, 프로테이나제, 옥시도리덕타제, 페놀-리아제, 디할로게나제, 이소머라제, 모노옥시지나제 및 디옥시지나제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법
6 6
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소 반응에 의해 유리되는 페놀계 화합물은 페놀, o-클로로페놀, m-클로로페놀, p-클로로페놀, o-니트로페놀, m-니트로페놀, p-니트로페놀, 살리실산, 2-아미노페놀, 2-메톡시페놀, 카테콜, 리소시놀, 3-메틸카테콜, 2,4-디메틸페놀, 2,5-디메틸페놀, 3,4-디메틸페놀, 2,3-디메틸페놀, 3,5-디메틸페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,5-디클로로페놀, 2,3-디클로로페놀, 2,6-디클로로페놀, 3,4-디클로로페놀, 3,5-디클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 2-에틸페놀, 3-에틸페놀, 2-플로로페놀, 2-요오드페놀 및 벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법
7 7
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물은 페놀 히드록실기가 수식된 에스테르; 글리코사이드; 인산에스테르; 오르쏘-, 메타- 또는 파라- 위치에 알킬기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 아마이드기, 설파이드기, 니트로기 또는 할로겐기가 도입된 페놀 유도체; 및 벤젠고리 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
8 8
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질은 DmpR(transcriptional regulator for dmp(dimethylphenol)) 인 것을 특징으로 하는 방법
9 9
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광단백질은 GFP(greeen fluorescence protein:녹색형광단백질), GFPUV(UV-activating GFP: 자외선여기녹색형광단백질), 및 RFP(red fluorescence protein:적색형광단백질)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
10 10
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 유전자, 클로람페니콜 유전자 및 테트라사이클린 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
11 11
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석(FACS) 및 항생제 내성 측정법으로부터 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법
12 12
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 슈도모나스, 효모, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
13 13
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자회로는 리포터 단백질의 발현효율을 높이기 위해 RBS (Ribosome binding site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
14 14
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 하는 방법
15 15
제1항 또는 제2항에 있어서, 제한효소 처리에 의해 상기 효소 유전자를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법
16 16
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자회로는 자살 유전자 sacB를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
17 17
제1항 또는 제2항에 있어서, 형질전환된 미생물의 세포 성장값(OD600/ml)이 1
18 18
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 방출 화합물을 처리 후, 효소반응을 14 ~ 16시간 동안 진행시키는 것을 특징으로 하는 방법
19 19
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물을 처리하는 단계는 (i) 영양배지에서 성장된 미생물을 회수하는 단계; 및 (ii) 상기 회수된 미생물을 최소배지에서 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법
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