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강제전사를 통한 메타게놈 유래 유용효소의 고효율 탐색방법

  • 기술번호 : KST2014061310
  • 담당센터 : 대전기술혁신센터
  • 전화번호 : 042-610-2279
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 메타게놈 라이브러리로부터 고효율로 유용효소를 탐색하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 메타게놈 유래 유전자를 양방향 프로모터를 채용한 강제전사 시스템을 이용하여 외래 유전자의 발현을 강제적으로 증가시키고, 전사조절단백질을 기반으로 하는 재설계 유전자회로와 함께 연계하여 사용하는 것을 특징으로 하는 고효율로 유용효소를 탐색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존에 발현효율이 낮아서 목적 유전자의 활성을 직접 탐색하는데 많은 어려움이 있었던 메타게놈 유래 외래 유전자를 양방향 프로모터를 채용한 강제전사 시스템을 이용하여 외래 유전자의 발현을 강제적으로 증가시키고, 전사조절단백질을 기반으로 하는 재설계 유전자회로와 함께 연계하여 사용함으로써, 목적 효소에 의하여 생성된 극미량의 반응산물 조차도 형광 및 항생제 저항성 등 리포터 단백질의 발현을 통하여 감지할 수 있어, 고효율로 목적 유전자의 선별 및 목적 유전자 활성의 정량측정이 가능하다.
Int. CL C12Q 1/34 (2006.01) C12Q 1/48 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12Q 1/26 (2006.01)
CPC C12N 15/1086(2013.01) C12N 15/1086(2013.01)
출원번호/일자 1020110103459 (2011.10.11)
출원인 한국생명공학연구원
등록번호/일자 10-1550389-0000 (2015.08.31)
공개번호/일자 10-2013-0039034 (2013.04.19) 문서열기
공고번호/일자 (20150908) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2012.09.27)
심사청구항수 21

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 이승구 대한민국 대전광역시 유성구
2 최수림 대한민국 대전광역시 유성구
3 나유진 대한민국 대전광역시 유성구
4 송재준 대한민국 대전광역시 유성구
5 이상준 대한민국 대전광역시 유성구
6 권길광 대한민국 대전광역시 유성구
7 김은미 대한민국 대전광역시 유성구
8 최종현 대한민국 대전광역시 유성구
9 권오석 대한민국 대전광역시 유성구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 이처영 대한민국 서울특별시 강남구 언주로 ***, **층 (역삼동, 윤익빌딩)(*T국제특허법률사무소)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구
번호, 서류명, 접수/발송일자, 처리상태, 접수/발송일자의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 행정처리 표입니다.
번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2011.10.11 수리 (Accepted) 1-1-2011-0792225-47
2 [출원서등 보정]보정서
[Amendment to Patent Application, etc.] Amendment		 2011.11.07 수리 (Accepted) 1-1-2011-0874736-67
3 [심사청구]심사청구(우선심사신청)서
[Request for Examination] Request for Examination (Request for Preferential Examination)		 2012.09.27 수리 (Accepted) 1-1-2012-0790980-88
4 선행기술조사의뢰서
Request for Prior Art Search		 2013.10.07 수리 (Accepted) 9-1-9999-9999999-89
5 선행기술조사보고서
Report of Prior Art Search		 2013.11.13 수리 (Accepted) 9-1-2013-0092578-41
6 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2014.03.05 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2014-0162364-81
7 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2014.04.30 수리 (Accepted) 1-1-2014-0413139-99
8 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2014.04.30 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2014-0413140-35
9 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2014.09.23 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2014-0645689-54
10 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2014.11.21 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2014-1127265-81
11 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2014.11.21 수리 (Accepted) 1-1-2014-1127264-35
12 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2015.02.05 수리 (Accepted) 4-1-2015-0007152-08
13 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2015.03.25 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2015-0200752-19
14 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2015.05.22 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2015-0494958-21
15 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2015.05.22 수리 (Accepted) 1-1-2015-0494956-30
16 등록결정서
Decision to grant		 2015.08.26 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2015-0579022-85
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번호 청구항
1 1
다음 단계를 포함하는 강제전사시스템 및 재설계 유전자회로를 이용한 메타게놈 라이브러리로부터 목적효소를 탐색하는 방법:(a) 탐색하고자 하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유전자에 트랜스포사제(transposase) 인식부위(Mosaic End, ME), 프로모터, 항생제 저항성 유전자, 역방향 프로모터 및 역방향 트랜스포사제 인식부위 서열을 포함하는 트랜스포손과 트랜스포사제를 반응시켜 상기 트랜스포손이 무작위로 삽입된 메타게놈 라이브러리를 제작하는 단계; (b) (a)단계의 프로모터 및 역방향 프로모터의 발현을 활성화 시킬 수 있는 RNA 중합효소(polymerase)가 삽입된 숙주미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제작하는 단계; (c) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 상기 (a)단계의 메타게놈 라이브러리에 도입하는 단계; (d) 목적효소 탐색시 상기 프로모터가 작동할 수 있도록 재조합 미생물 라이브러리에 유도물질(inducer)을 처리하여 배양하는 단계; (e) 상기 배양된 재조합 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (f) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (g) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계
2 2
제1항에 있어서, 상기 트랜스포손의 프로모터는 T7 프로모터, lac 프로모터, ara프로모터, trc 프로모터 및 Phce프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
3 3
제1항에 있어서, (b) 단계의 RNA 중합효소(polymerase)는 미생물 유래의 RNA 중합효소 또는 파아지 유래 T7 RNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법
4 4
제1항에 있어서, 트랜스포사제(transposase) 인식부위는 Tn5트랜스포손, IS 트랜스포손, Tn3 트랜스포손, Tn7트랜스포손(site-specific transposon), 및 Mu 트랜스포손으로 구성된 군에서 선택되는 트랜스포손의 트랜스포사제(transposase) 인식부위인 것을 특징으로 하는 방법
5 5
제1항에 있어서, 상기 트랜스포사제(transposase) 인식부위(Mosaic End, ME)는 Tn5트랜스포사제(transposase) 인식부위이고, 상기 Tn5트랜스포사제(transposase) 인식부위는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
6 6
제2항에 있어서, 상기 프로모터는 T7 프로모터이고, 상기 T7 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
7 7
제1항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 엠피실린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
8 8
제1항에 있어서, 상기 트랜스포손은 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법
9 9
제1항에 있어서, 상기 트랜스포사제는 박테리아 유래의 Tn5 트랜스포사제(transposase)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
10 10
제6항에 있어서, 상기 T7 프로모터를 작동시키기 위한 유도물질로서, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 또는 락토오스(lactose)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
11 11
제1항에 있어서, 상기 메타게놈 라이브러리가 플라스미드, 포스미드, 코스미드, BAC 및 YAC로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 토양으로부터 얻은 DNA를 도입하여 제작된 것을 특징으로 하는 방법
12 12
제1항에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위는 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자가 발현될 수 있도록 리포터유전자의 프로모터를 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법
13 13
제1항에 있어서, 상기 효소는 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 셀룰라제, 글리코실세라미다제, 포스파아타제, 피타제, 에스터라제, 리파제, 유레타나제, 아미다제, 펩티다제, 프로테이나제, 옥시도리덕타제, 페놀-리아제, 디할로게나제, 이소머라제, 모노옥시지나제 및 디옥시지나제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법
14 14
제1항에 있어서, 효소 반응에 의해 유리되는 페놀계 화합물은 페놀, o-클로로페놀, m-클로로페놀, p-클로로페놀, o-니트로페놀, m-니트로페놀, p-니트로페놀, 살리실산, 2-아미노페놀, 2-메톡시페놀, 카테콜, 리소시놀, 3-메틸카테콜, 2,4-디메틸페놀, 2,5-디메틸페놀, 3,4-디메틸페놀, 2,3-디메틸페놀, 3,5-디메틸페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,5-디클로로페놀, 2,3-디클로로페놀, 2,6-디클로로페놀, 3,4-디클로로페놀, 3,5-디클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 2-에틸페놀, 3-에틸페놀, 2-플로로페놀, 2-요오드페놀 및 벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법
15 15
제1항에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물은 페놀 히드록실기가 수식된 에스테르; 글리코사이드; 인산에스테르; 오르쏘-, 메타- 또는 파라- 위치에 알킬기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 아마이드기, 설파이드기, 니트로기 또는 할로겐기가 도입된 페놀 유도체; 및 벤젠고리 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
16 16
제1항에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질은 DmpR 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 하는 방법
17 17
제1항에 있어서, 상기 형광단백질은 GFP, GFPUV, 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
18 18
삭제
19 19
제1항에 있어서, 상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석(FACS) 및 항생제 내성 측정법으로부터 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법
20 20
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 슈도모나스 및 효모로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
21 21
제1항에 있어서, 상기 유전자회로는 리포터 단백질의 발현효율을 높이기 위해 RBS (Ribosome binding site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
22 22
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 하는 방법
지정국 정보가 없습니다
패밀리정보가 없습니다
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순번 연구부처 주관기관 연구사업 연구과제
1 농림수산식품부(농림부) 한국생명공학연구원 농림기술개발사업 비목재자원을활용한바이오신소재개발:고온성효모(KM)세포공장플랫폼구축및그린바이오신소재생산기술개발
2 교육과학기술부 한국생명공학연구원 미래기반기술개발사업 메타게놈맞춤발현및초고속효소탐색신기술개발
3 교육과학기술부 한국생명공학연구원 협동연구개발사업(기초기술연구회) Cellulose-basedbiofuel생산효율향상을위한합성생물학기술개발