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프로모터(promoter), 락토오즈 오퍼레이터(lactose operator, lacO) 및 유전자 3-프레임 동시번역(Three Frame Simultaneous Translation, TFST) 컨스트럭트를 포함하는 발현 카세트로서, DNA 단편을 연결하면 연결된 DNA 단편이 한 개의 전사 단위로 전사되며 이로부터 다시 3개 프레임의 폴리펩티드가 동시에 번역되는, 유전자 강제 발현 카세트
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제 1항에 있어서, 상기 TFST 컨스트럭트는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS), 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS), 개시 코돈(ATG), 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS), 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈(ATG)이 순차적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 1항에 있어서, 상기 TFST 컨스트럭트는 서열번호 14의 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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프로모터, 락토오즈 오퍼레이터 및 TFST 컨스트럭트를 포함하며 정방향으로 도입된 첫 번째 유전자 강제 발현 카세트;rrnB 전사종결자; 및프로모터, 락토오즈 오퍼레이터 및 TFST 컨스트럭트를 포함하며 첫 번째 유전자 강제 발현 카세트의 역방향으로 도입된 두 번째 유전자 강제 발현 카세트를 포함하고, 상기 2개 유전자 강제발현 카세트 사이에 rrnB 전사종결자를 대신하여 DNA 단편을 연결하면 연결된 DNA 단편이 양방향 프로모터로부터 각각 1개의 전사단위로 전사되고, 이들로부터 각각 3개 프레임의 폴리펩티드가 양방향으로 번역되어, 총 6개 프레임의 폴리펩티드가 동시에 번역되는 양방향 유전자 강제 발현 카세트
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제 4항에 있어서, 양방향 유전자 강제 발현 카세트의 첫 번째 유전자 강제 발현 카세트의 TFST 컨스트럭트는 리보솜 결합 부위, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 개시 코돈이 순차적으로 작동가능하게 연결되고, 두 번째 유전자 강제 발현 카세트의 TFST 컨스트럭트는 개시 코돈, 개시 코돈, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 리보솜 결합 부위 및 리보솜 결합 부위가 순차적으로 연결되어 첫 번째 TFST 컨스트럭트의 역박향으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 프로모터는 T7 프로모터(promoter)인 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 2항 또는 제 5항에 있어서, 상기 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS)는 서열번호 7의 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 4항에 있어서, rrnB 전사종결자는 서열번호 23의 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 4항에 있어서, 첫 번째 발현 카세트의 TFST 컨스트럭트는 서열번호 14의 염기 서열로 구성되고, 두 번째 발현 카세트의 TFST 컨스트럭트는 서열번호 24의 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 강제 발현 카세트
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제 1항 또는 제 4항의 유전자 강제 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터
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제 10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 클로닝되는 DNA 단편이 1개의 전사 단위로 전사되고 이로부터 3개 프레임(frame)의 폴리펩티드로 번역되어 발현될 수 있거나, 또는 클로닝되는 DNA 단편이 각각의 프로모터로부터 양방향으로 각각 1개의 전사단위로 전사되고, 이들로부터 각각 3개 프레임의 폴리펩티드가 번역되어, 총 6개 프레임의 폴리펩티드가 번역되어 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터
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제 10항의 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체
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제 12항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E
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1) 메타게놈(metagenome) 유래 DNA를 제한 효소로 절단하는 단계; 및2) 상기 단계 1)의 절단된 DNA를 제 10항의 발현 벡터에 삽입하는 단계를 포함하는 메타게놈 유래 유전자 라이브러리 제작 방법
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제 14항에 있어서, 상기 단계 1)의 절단은 Sau3A1 제한 효소로 부분 절단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 메타게놈 유래 유전자 라이브러리 제작 방법
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제 14항에 있어서, 상기 단계 1)의 절단은 기계적 절단 후 평활 말단(blunt end)으로 만드는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 메타게놈 유래 유전자 라이브러리 제작 방법
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1) 메타게놈으로부터 DNA를 분리하는 단계;2) 단계 1)의 DNA를 제 10항의 발현 벡터에 삽입하는 단계;3) 단계 2)의 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및4) 단계 3)의 형질전환체를 배양하여 단백질 발현을 검증하는 단계를 포함하는, 메타게놈 유래 활성 유전자 스크리닝 방법
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