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가교제와 반응하여 가교화된 단백질 결합체를 형성할 수 있는 작용기를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 0 ~ 6%인 표적 단백질과, 상기 표적 단백질보다 리신의 함량이 많은 교차보조 단백질의 혼합 단백질을 가교제와 반응시켜 상기 혼합 단백질의 가교 결합된 결합체를 얻는 단계를 포함하는 단백질의 고정화 방법
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(a) 액상 매질 내에 존재하는 단백질을 침전시키는 단계로서, 상기 단백질은 가교제와 반응하여 가교화된 단백질 결합체를 형성할 수 있는 작용기를 갖는 아미노산인 리신의 함량이 0 ~ 6%인 표적 단백질과, 상기 표적 단백질보다 리신의 함량이 많은 교차보조 단백질을 포함하는 단백질을 침전시키는 단계와;
(b) 상기 침전된 표적 단백질과 교차보조 단백질의 혼합 단백질의 물리적 결합체를 가교제와 반응시켜 상기 혼합 단백질의 화학적으로 가교 결합된 결합체를 형성하는 단계를 포함하는 단백질의 고정화 방법
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제 2항에 있어서,
상기 (a) 단계는 상기 표적 단백질과 상기 교차보조 단백질의 혼합 단백질을 상기 액상 매질 내에서 용해시킨 상태에서 침전제를 투입하여 수행되거나, 상기 표적 단백질과 상기 교차보조 단백질이 각각 용해되어 있는 액상 매질 내에 침전제를 투입하여 각각 형성된 표적 단백질의 침전물과 교차보조 단백질의 침전물을 혼합하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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제 3항에 있어서,
상기 표적 단백질은 서열번호 1의 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 아미다아제 또는 서열번호 3의 포토박테리움(Photobacterium lipolyticum) 유래의 M37 리파아제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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5
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 교차보조 단백질은 서열번호 5의 소혈청알부민(BSA)인 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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제 2항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 사용되는 침전제는 황산암모늄((NH4)2SO4)과 같은 수용성 염, 부틸알코올, 디메톡시에탄(DME) 또는 아세톤과 같은 유기용매 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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7
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 가교제는 글루타르알데하이드, 덱스트란 폴리알데하이드, 디메틸아디피미데이트 디하이드로클로라이드(DMA), 디메틸 수베리미데이트 디하이드로클로라이드(DMS), 디숙신이미딜 수버레이트, 숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)-아미노벤조에이트, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오-프로피오네이트)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 표적 단백질과 상기 교차보조 단백질은 1:2 ~ 2:1의 중량비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질의 고정화 방법
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제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 기재되어 있는 공정을 통하여 고정화된 혼합 단백질의 결합체를 상기 표적 단백질이 매개하는 화학적 변환 공정에 사용하는 방법
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10
제 9항에 있어서,
상기 고정화된 혼합 단백질의 결합체는 상기 화학적 변환 공정에서 반복적으로 사용될 수 있는 방법
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11
제 9항에 있어서,
상기 표적 단백질은 서열번호 1의 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 아미다아제 또는 서열번호 3의 포토박테리움(Photobacterium lipolyticum) 유래의 M37 리파아제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
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12
제 11항에 있어서,
상기 표적 단백질은 서열번호 1의 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 아미다아제로서, 상기 화학적 변환 공정은 상기 아미다아제가 매개하는 키랄 중간체 제조 공정에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법
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13
제 12항에 있어서,
상기 고정화된 혼합 단백질의 결합체는, 상기 아미다아제에 의하여 고지혈증 치료제의 키랄 중간체의 제조 공정에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법
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