| 1 |
1
(a) (i) 목적 유전자, (ii) 억제 가능한 제1 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 억제 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 (iii) 제1 리포터 유전자를 포함하는 도입벡터; 및, (i) 억제 가능한 제2 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 발현 카세트, 및 (ii) 제1 억제 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 준비하는 단계로서,상기 제1 억제 유전자의 발현은 상기 제1 프로모터의 활성을 억제시키고, 상기 제2 억제 유전자의 발현은 제2 프로모터의 활성을 억제시키는 것인 단계;(b) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 돌연변이를 유도하고자 하는 목적 균주에 도입하여 도입벡터의 목적 유전자와 목적 균주의 염색체내의 내재 유전자 간의 1차 단일 교차(single crossover)를 유도한 다음, 상기 제1 프로모터를 활성화시켜 염색체 내의 2차 단일 교차를 유도함으로써, 상기 1차 및 2차 단일 교차에 의하여 목적 균주에 돌연변이가 유도된 형질전환체를 수득하는 단계; 및(c) 상기 형질전환체로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하여 변이 균주를 수득하는 단계를 포함하는,목적 유전자가 도입된 변이 균주의 제조방법
|
| 2 |
2
제1항에 있어서,상기 목적 유전자는, 이에 상응하는 목적 균주의 유전자에 도입하기 위한 변이서열을 포함하는 것인 방법
|
| 3 |
3
삭제
|
| 4 |
4
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 제1 프로모터를 활성화시키는 경우 제2 억제 유전자가 발현되어 제2 프로모터의 활성이 억제됨으로써, 제2 리포터 유전자의 발현이 억제되는 것인 방법
|
| 5 |
5
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 목적 균주에 도입하여 도입벡터와 목적 균주의 염색체 간의 1차 단일 교차(single crossover)를 유도하는 단계; (b2) 제1 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 1차 단일 교차가 유도된 재조합 균주를 선별하는 단계;(b3) 상기 제1 프로모터를 활성화시켜 상기 재조합 균주의 염색체 내의 2차 단일 교차를 유도하는 단계; 및, (b4) 제2 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 2차 단일 교차가 유도된 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 것인 방법
|
| 6 |
6
제5항에 있어서,상기 (b1) 단계의 1차 단일 교차는 목적 유전자 내 변이서열의 상류에서 발생하는 것인 방법
|
| 7 |
7
제5항에 있어서,상기 (b3) 단계의 2차 단일 교차는 목적 유전자 내 변이서열의 하류에서 발생하는 것인 방법
|
| 8 |
8
제5항에 있어서,상기 (b4) 단계의 형질전환체는 염색체 내에서 제1 발현 카세트와 제1 리포터 유전자가 제거된 것인 방법
|
| 9 |
9
제1항에 있어서, 상기 방법은 최종적으로 목적 유전자를 제외한 외부에서 도입된 성분이 모두 제거된 상태로 돌연변이가 유도되는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 10 |
10
제1항에 있어서, 상기 제1 프로모터의 활성화는 제1 프로모터의 활성을 증가시키는 물질을 처리하여 수행되는 것인 방법
|
| 11 |
11
제1항에 있어서,상기 제1 리포터 유전자와 제2 리포터 유전자는 동일하지 않은 항생제 내성 유전자인 것인 방법
|
| 12 |
12
제1항에 있어서,상기 제1 프로모터는 xylA 프로모터(Pxyl)이고, 상기 제2 억제 유전자는 lacI 유전자이며, 상기 제1 프로모터의 활성화는 자일로스를 처리하여 수행되고, 상기 제1 리포터 유전자는 neo 유전자이며, 상기 제2 프로모터는 spac 프로모터(Pspac)이고, 상기 제2 리포터 유전자는 cat 유전자이며, 상기 제1 억제 유전자는 xylR 유전자인 것인 방법
|
| 13 |
13
제1항에 있어서,상기 (c)단계는 상기 형질전환체를 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양하여 수행되는 것인 방법
|
| 14 |
14
(a) (i) 목적 유전자, (ii) 억제 가능한 제1 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 억제 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 (iii) 제1 리포터 유전자를 포함하는 도입벡터; 및, (b) (i) 억제 가능한 제2 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 발현 카세트, 및 (ii) 제1 억제 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 상기 제1 억제 유전자의 발현산물은 상기 제1 프로모터의 활성을 억제시키고, 상기 제2 억제 유전자의 발현산물은 제2 프로모터의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는,변이 균주 제조용 조성물
|
| 15 |
15
제14항에 있어서,상기 조성물은 제1항의 방법에 사용되는 것인 조성물
|
| 16 |
16
제14항의 조성물을 포함하는, 변이 균주 제조용 키트
|
