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서열번호 2 의 서열을 갖는 Tn5 전위효소 인식부위, 서열번호 4의 서열을 갖는 tetR 유전자, 서열번호 3의 서열을 갖는 Tnγδ 전위효소 인식부위, 서열번호 5의 서열을 갖는 CmR 유전자, 서열번호 3의 서열과 역상보적인 Tnγδ 전위효소 인식부위, 서열번호 6의 서열을 갖는 sacB 유전자 및 서열번호 2 의 서열과 역상보적인 Tn5 전위효소 인식부위를 5'→3' 방향으로 차례로 포함하는 트랜스포존 TnRIBD
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제 1 항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 트랜스포존 TnRIBD
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트랜스포존 전위효소 인식부위 및 선별마커를 포함하는 트랜스포존을 제조하는 단계; 상기 트랜스포존을 미생물 염색체의 임의의 위치에 삽입시키고, 염색체 염기서열 분석을 통하여 삽입된 위치를 확인하는 단계; 및 상기 염색체에 전위효소 발현벡터를 도입하여 삽입된 트랜스포존의 좌우 염색체 부분을 제거하는 단계를 포함하는, 임의의 염색체 부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법
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제 3 항에 있어서, 상기 트랜스포존이 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 트랜스포존 TnRIBD인 미생물 변이주 제조방법
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5
제 3 항에 있어서, 상기 트랜스포존이, pDELTA2 벡터로부터 sacB와 Tnγδ의 전위효소 인식부위를, Tn10로부터 tetR을, pKClox 벡터로부터 CmR 유전자를 PCR을 수행하여 증폭하여 얻는 단계, 리가아제를 이용하여 선상의 pMOD 벡터에 sacB, tetR, CmR, Tnγδ의 OE를 삽입하여 pRIBD 벡터를 제조하는 단계 및, 상기 pRIBD 벡터를 제한효소 XhoI으로 절단하여 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 트랜스포존 TnRIBD을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 미생물 변이주 제조방법
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제 3 항에 있어서, 상기 전위효소 발현벡터를, pXRD4043를 제한효소 NaeI/ClaI으로 절단하여 전위효소 관련 유전자 tnpA를 포함하는 절단말단의 유전자 단편을 제조한 후, 이를 제한효소 BamHI로 절단하여 얻은 절단말단을 갖는 선상의 벡터 pEL3에 리가아제를 이용하여 삽입하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조하여 사용하는 미생물 변이주 제조방법
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제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 임의의 염색체 부위를 제거하여 새로운 미생물 변이주를 제조하고, 제거된 부분의 유전자를 확인한 후, 상기 주어진 변이주의 성장조건에서의 생존여부를 조사하여 생장에 비필수적인 미생물 유전자를 선별하는 방법
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제 7 항에 있어서, 트랜스포존 내부 및 외부에 위치하는 일정 간격을 두고 결정한 두 개의 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 분자내 전위를 통한 임의의 염색체 부위의 절단 크기를 확인하는 단계를 포함하는 생장에 비필수적인 미생물 유전자를 선별하는 방법
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제 8 항에 있어서, 상기 두 개의 프라이머로서 서열번호 12의 서열을 갖는 프라이머 C3과 서열번호 13의 서열을 갖는 프라이머 p15를 사용하여 절단 크기를 확인하는 단계를 포함하는 생장에 비필수적인 미생물 유전자를 선별하는 방법
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제 8 항에 있어서, 상기 두 개의 프라이머로서 서열번호 14의 서열을 갖는 프라이머 C5과 서열번호 15의 서열을 갖는 프라이머 m10을 사용하여 절단 크기를 확인하는 단계를 포함하는 생장에 비필수적인 미생물 유전자를 선별하는 방법
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제 8 항에 있어서, 상기 두 개의 프라이머로서 서열번호 14의 서열을 갖는 프라이머 C5과 서열번호 15의 서열을 갖는 프라이머 m10을 사용하여 절단 크기를 확인하는 단계를 포함하는 생장에 비필수적인 미생물 유전자를 선별하는 방법
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