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(1) 리포터 유전자(R)가 결실된 변이 세포를 제조하는 단계; (2) 리포터 유전자(R)가 삽입된 자동 선별 벡터를 제조하는 단계;(3) 리포터 단백질의 분비를 유도하는 단백질융합인자를 포함한 유전자 절편을 단계 (2)의 자동 선별 벡터와 연결하여 단백질융합인자 라이브러리(L)를 제조하는 단계;(4) 단백질융합인자 라이브러리(L)를 리포터 단백질의 활성이 없는 세포에 형질전환시켜 리포터 단백질의 활성을 나타내는 세포로부터 단백질융합인자 라이브러리(L)을 수득하는 단계; (5) 단계 (4)에서 수득한 단백질융합 인자 라이브러리(L) 및 난발현성 목적단백질 유전자(X)를 리포터 단백질의 활성이 없는 세포에 도입하여 세포내 상동성 재조합을 수행하는 단계; 및(6) 난발현성 목적단백질을 분비하고 리포터 단백질 활성을 나타내는 세포로부터 유전자를 분리하여 단백질융합인자의 특성을 분석하는 단계를 포함하여, 단백질융합인자를 선별하는 방법
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제1항에 있어서, 리포터 유전자가 인버테이즈, 아밀레이즈, 글루코아밀레이즈, 갈락토시데이즈, 수크레이즈, 셀루레이즈, 자일라네이즈, 말테이즈, 포스파테이즈, 베타 락타메이즈, 리파제 및 단백질 분해효소에서 선택되는 유전자인 방법
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제1항에 있어서, 난발현성 목적단백질이 사이토카인, 혈청단백질, 면역글로불린, α-, β- 및 γ-인터페론, 콜로니자극인자, 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자, 호르몬, 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(GHPR), 흉선 체액성 인자(THF), 줄기세포인자(SCF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피성장인자(EGF), 락토페린, 사이토카인 리셉터, 항체, 인간화 항체, 치료용 항체, 백신, 항암 및 항생기능을 갖는 기능성 펩타이드, 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 리파제, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제 중에서 선택되는 방법
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제1항에 있어서, 리포터 단백질의 분비를 유도하는 단백질융합인자를 포함한 유전자 절편이 게놈성 DNA 또는 cDNA 절편인 방법
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제4항에 있어서, 게놈성 DNA 또는 cDNA가 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus) 및 트리코더마(Trichoderma) 중에서 유래되는 방법
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제1항에 있어서, 리포터 단백질의 활성이 없는 세포가 효모인 방법
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제6항에 있어서, 리포터 단백질의 활성이 없는 세포가 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus) 및 트리코더마(Trichoderma)중에서 선택되는 방법
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(1) 인버테이즈 유전자를 결실시킨 인버테이즈 활성이 결여된 효모 세포를 제조하는 단계; (2) 효모 GAL10 프로모터 및 분비시그널-비함유 인버테이즈 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;(3) 효모의 유전자 전사체로부터 랜덤헥사머를 이용하여 증폭된 cDNA 절편 또는 효모의 게놈성 DNA 절편을 단계 (2)의 벡터에 삽입하여 단백질융합인자 DNA 라이브러리를 제조하는 단계;(4) 단계 (3)에서 제조된 라이브러리를 단계 (1)에서 제조된 효모에 형질전환하여 수크로즈를 단일 탄소원으로 포함하고 있는 배지에서 선별된 단백질융합인자 라이브러리를 제조하는 단계;(5) 단계 (4)에서 수득된 단백질융합인자 라이브러리 및 난발현성 목적단백질 유전자를 단계 (1)에서 제조된 효모에 도입하여 세포내 상동성 재조합을 수행하는 단계;(6) 난발현성 목적단백질을 분비하고 인버테이즈 활성을 나타내는 세포로부터 유전자를 분리하여 단백질융합인자의 특성을 분석하는 단계를 포함하여, 단백질융합인자를 선별하는 방법
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제8항에 있어서, 단계 (2)에서 효모 GAL10 프로모터 및 분비시그널-비함유 인버테이즈 유전자를 포함하는 벡터가 도 6에 도시된 YGalNV, 또는 도 7에 도시된 벡터 YGaF0INV, YGaF1INV 또는 YGaF2INV인 방법
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제9항에 있어서, 단계 (3)에서 cDNA 절편을 YGaINV 벡터의 SfiI 제한효소 위치에 연결하여 단백질융합인자 cDNA 라이브러리를 제조하거나, 효모의 게놈성 DNA 절편을 Sau3A 제한효소로 부분절단하고 2 베이스를 채운(filled-in) 후 YGaF0INV, YGaF1INV 또는 YGaF2INV 벡터의 2 베이스가 채워진 XhoI 제한효소 위치에 연결하여 단백질융합인자 게놈성 DNA 라이브러리를 제조하는 방법
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제8항에 있어서, 단계 (4)에서 선별한 효모 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하고 SfiI 제한효소로 처리하여 수득한 단백질융합인자 DNA 단편을 인버테이즈의 아미노말단의 45개 아미노산이 제거되어 인버테이즈의 활성이 없는 유전자가 포함된 도 10에 도시된 벡터 YGadV45에 연결하여 단백질융합인자 라이브러리를 제조하는 방법
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제8항에 있어서, 단계 (5)에서 난발현성 목적단백질 유전자가 리파제 유전자와 인프레임으로 연결되는 방법
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제8항 또는 제12항에 있어서, 단계 (6)에서 수크로즈 배지에서 성장하는 효모 균체 또는 리파제 기질을 분해하여 콜로니 주위에 투명환을 형성하는 효모균체로부터 유전자를 분리하는 방법
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서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 41 또는 43의 아미노산 서열, 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 단백질융합인자(TFP: translational fusion partner) 활성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 단백질:
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제14항의 단백질융합인자 단백질을 코딩하는 유전자
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제15항에 있어서, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 42 또는 서열번호 44의 핵산 서열을 갖는 유전자
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제15항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터
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제17항에 있어서, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 42 또는 서열번호 44의 핵산 서열을 포함하는 벡터
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제17항에 있어서, pYGT9-IL2(KCTC 10828 BP), pYGT13-IL2, pYGT17-IL2(KCTC 10829 BP), pYGT18-IL2, pYGT20-IL2, pYGT21-IL2 및 pYGT25-IL2 중에서 선택되는 벡터
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제17항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체
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제20항에 있어서, 형질전환되는 세포가 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 중에서 선택되는 효모인 형질전환체
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제15항의 단백질융합인자 단백질을 코딩하는 유전자와 난발현성 단백질을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계 및 재조합 발현 벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함하여, 난발현성 단백질을 제조하는 방법
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