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4차 연속 피씨알, 4차 블록 피씨알, 또는 유전자 합성방법을 이용한 균주 특이적 바코드를 포함하는 유전자 적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법

  • 기술번호 : KST2015170796
  • 담당센터 : 대전기술혁신센터
  • 전화번호 : 042-610-2279
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 유전자적중(targeted gene deletion) 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 이형접합균주(heterozygous strains)를 체계적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 상동성재조합(homologous recombination)에 사용되는 결손카세트(deletion cassette)를 4차 연속 효소중합연쇄반응(4-round serial PCR), 4차 블록(block) PCR, 또는 유전자합성(total gene synthesis) 방법을 이용하여 효율적으로 제조하고, 이를 분열효모에 형질전환(transformation)하여 유전자적중 분열효모 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 유전자 적중 분열 효모 이형접합 균주 및 유전자 적중 분열효모 이형접합 균주 라이브러리에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 라이브러리를 이용한 약물 작용점 탐색 방법 및 상기 라이브러리를 포함하는 신규약물 스크리닝에 관한 것이다. 이형접합체 균주, 4차 연속 PCR, 4차 블록 PCR, 유전자 적중, 분열효모 균주, 바코드 서열, 결손 카세트, 라이브러리, 약물 작용점 탐색
Int. CL C12N 15/00 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12N 1/16 (2006.01)
CPC
출원번호/일자 1020080037420 (2008.04.22)
출원인 한국생명공학연구원
등록번호/일자 10-1098032-0000 (2011.12.16)
공개번호/일자 10-2009-0111695 (2009.10.27) 문서열기
공고번호/일자 (20111223) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2008.04.22)
심사청구항수 17

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 허광래 대한민국 대전 유성구
2 김동욱 대한민국 대전 유성구
3 원미선 대한민국 대전 서구
4 유향숙 대한민국 대전시 서구
5 김동섭 대한민국 대전 유성구
6 박한오 대한민국 대전 유성구
7 정경숙 대한민국 대전시 유성구
8 장영주 대한민국 서울 광진구
9 남미영 대한민국 대전 중구
10 한상조 대한민국 대전 유성구
11 최신정 대한민국 대전 유성구
12 백승태 대한민국 대전 서구
13 김형배 대한민국 서울 송파구
14 허경선 대한민국 대전 유성구
15 이혜미 대한민국 대전 유성구
16 이민호 대한민국 대전 유성구
17 박조영 대한민국 충남 청양군

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 손민 대한민국 서울특별시 송파구 법원로 ***, *층(문정동)(특허법인한얼)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구
번호, 서류명, 접수/발송일자, 처리상태, 접수/발송일자의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 행정처리 표입니다.
번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2008.04.22 수리 (Accepted) 1-1-2008-0287928-20
2 서열목록제출서
Submission of List of Sequence		 2008.04.24 수리 (Accepted) 1-1-2008-5021736-39
3 보정요구서
Request for Amendment		 2010.07.06 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2010-0290593-05
4 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2010.07.21 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2010-0470867-30
5 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2010.12.13 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2010-0569913-88
6 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)		 2011.02.11 수리 (Accepted) 1-1-2011-0100224-16
7 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)		 2011.03.11 수리 (Accepted) 1-1-2011-0177680-94
8 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)		 2011.04.13 수리 (Accepted) 1-1-2011-0270120-53
9 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2011.05.13 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2011-0356707-37
10 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2011.05.13 수리 (Accepted) 1-1-2011-0356706-92
11 등록결정서
Decision to grant		 2011.11.30 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2011-0710825-78
12 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2015.02.05 수리 (Accepted) 4-1-2015-0007152-08
번호, 청구항의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 청구항 표입니다.
번호 청구항
1 1
1) 선택 마커 유전자, 상기 선택 마커 유전자의 좌우에 배치된 표적 유전자 특이적 바코드 염기서열, 및 상기 바코드 염기서열의 좌우에 배치된 150 내지 450 bp 크기의 상동재조합 부위를 포함하는 유전자적중용 결손카세트를 4차 블록 PCR 또는 유전자합성법을 이용하여 제조하는 단계; 2) 단계 1)에서 제조된 유전자적중용 결손 카세트를 분열효모 균주에 형질전환시키는 단계; 및 3) 단계 2)에서 형질전환된 분열효모 균주에서 표적 유전자의 결손을 확인하는 단계를 포함하는, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
2 2
제1항에 있어서, 단계 1)의 바코드 염기서열의 좌우에 배치된 상동재조합 부위의 크기가 250 내지 450 bp인 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
3 3
제1항에 있어서, 단계 1)의 바코드 염기서열이 20 내지 30 bp 크기인 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
4 4
제1항에 있어서, 단계 1)의 선택 마커 유전자의 시작 코돈 앞쪽에 이종 효모 유래의 프로모터가 배치되고, 그의 종결 코돈 뒤쪽에 이종 효모 유래의 터미네이터가 배치되는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
5 5
제1항에 있어서, 단계 1)의 결손카세트가 선택 마커 유전자의 좌측에 배치된 바코드 염기서열을 증폭하기 위한 한 쌍의 공통 프라이머 부착 부위 및 선택 마커 유전자의 우측에 배치된 바코드 염기서열을 증폭하기 위한 한 쌍의 공통 프라이머 부착 부위를 추가로 포함하는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
6 6
제1항에 있어서, 단계 1)의 바코드 염기서열이 분열효모 균주에 특이적인 서열번호 18 내지 9993으로 기재되는 염기서열로부터 선택되는 대응하는 한 쌍의 5' 및 3' 쪽 바코드 염기서열인 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
7 7
제1항에 있어서, 단계 1)의 선택 마커 유전자가 영양 요구 마커(auxotrophic marker), 네오마이신 저항성 유전자(neoR), 카나마이신 저항성 유전자(kanR), 히그로마이신(hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(hisD), 구아닌 포스포리모실 트랜스퍼라제(gpt), 테트라사이클린(tetR), 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hprt), ura3, ble 및 sacB로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
8 8
제1항에 있어서, 상기 선택 마커 유전자가 카나마이신 저항성 유전자인 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
9 9
제1항에 있어서, 단계 1)의 결손카세트가 도 1의 구조를 갖는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
10 10
제1항에 있어서, 단계 3)에서 표적 유전자의 적중 확인이 표적 유전자와 상동성 재조합으로 치환된 결손카세트 내의 표적 유전자 특이적 바코드 염기서열을 PCR로 증폭하여 수행되는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
11 11
제1항의 방법에 의해 제조된, 표적 유전자가 적중된 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 라이브러리
12 12
1) 제11항에 따른 이형접합체 분열효모 균주의 라이브러리에 약물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)에서 약물 처리된 분열효모 균주의 라이브러리를 배양하는 단계; 및 3) 단계 2)에서 배양된 분열효모 균주 각각의 성장 정도를 비교하는 단계를 포함하는, 약물의 작용점 탐색방법
13 13
제12항에 있어서, 단계 3)에서 성장 정도의 비교가 배양된 분열효모 균주 각각으로부터 추출된 염색체를 마이크로어레이 유전자 칩 또는 실시간 PCR에 적용하여 성장 정도를 측정하고 비교하여 상대적으로 성장이 저해된 분열효모 균주를 확인함으로써 수행되는 것인, 약물의 작용점 탐색방법
14 14
제11항에 따른 이형접합체 분열효모 균주의 라이브러리를 포함하는 약물 스크리닝 키트
15 15
제1항에 있어서, 단계 1)에서 유전자적중용 결손카세트가 선택 마커 유전자와 그의 좌우에 배치된 바코드 염기서열, 상기 바코드 염기서열의 좌우에 배치되는 5' 상동재조합 부위, 및 3' 상동재조합 부위를 포함하는 3개의 DNA 절편을 각각 PCR로 제조한 후, 이들을 혼합하여 블록 PCR을 수행하는 4차 블록 PCR에 의해 제조되는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
16 16
제1항에 있어서, 단계 1)에서 유전자적중용 결손카세트가 선택 마커 유전자 부위, 상기 선택 마커 유전자의 좌우에 배치되는 5' 상동재조합 부위와 바코드 염기서열, 및 3' 상동재조합 부위와 바코드 염기서열을 포함하는 3개의 DNA 절편을 각각 합성한 후, 이들의 상호 중첩되는 부분에 배치된 연결 올리고에 의해 3개의 DNA 절편을 하나로 접합시키는 유전자합성법에 의해 제조되는 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
17 17
제1항에 있어서, 단계 2)에서 분열효모가 스키조사카로마이세스 옥토스포러스(Schizosaccharomyces octosporus) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 것인, 유전자적중 이형접합체 분열효모 균주의 제조방법
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3 JP05608637 JP 일본 FAMILY
4 JP23517957 JP 일본 FAMILY
5 US09670480 US 미국 FAMILY
6 US20110190163 US 미국 FAMILY
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3 EP2268808 EP 유럽특허청(EPO) DOCDBFAMILY
4 EP2268808 EP 유럽특허청(EPO) DOCDBFAMILY
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8 US9670480 US 미국 DOCDBFAMILY
9 WO2009131279 WO 세계지적재산권기구(WIPO) DOCDBFAMILY
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