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서열번호 2로 기재되는 sDR5 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터
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제 1항의 발현벡터를 포함하는 대장균(E
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1) 제 2항의 대장균 균주를 섭씨 37도에서 배양하면서 배양액에 IPTG를 첨가하여 sDR5 유전자를 발현시키는 단계; 2) 상기 균체를 파쇄하여 세포 추출물을 회수하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 회수한 세포 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 서열번호 2로 기재되는 sDR5의 분리·정제를 실시하는 단계로 구성되는 sDR5 단백질의 제조방법
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제 3항의 제조방법에 의해 생산된 sDR5 단백질
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서열번호 1로 기재되는 TRAIL 단백질과 제 4항의 sDR5 단백질을 혼합하여 제조한 TRAIL-sDR5 결합체
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1) 16% 폴리에틸렌글라이콜(polyethyleneglycol) 3000, 0
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제 6항의 결정화 방법에 의해 제조된 TRAIL-sDR5 결합체의 결정
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제 7항에 있어서, TRAIL-sDR5 결합체의 결정은 공간 그룹이 P63이고, 유니트 셀 디멘션(unit cell dimension)은 a = 68
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TRAIL-sDR5 결합체 형성시 sDR5 수용체와 결합하면서 TRAIL의 CD 루프와 EF 루프는 정열하게 되고 AA" 루프의 잔기 130-145는 커다란 위치변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 제 7항의 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조
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제 9항에 있어서, sDR5는 N1(잔기 28-41), CRD1(A1+B2, 잔기 44-84)과 CRD2(A1+B2, 잔기 86-125)의 모듈로 구성되는 것을 특징으로 하는 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조
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제 10항에 있어서, A1과 B2 모듈은 각각 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 보존 서열(consensus sequence)로 구성되어 있고, N1 모듈은 한 개의 다이설파이드(disulfide) 결합을 포함하고 있으면서 그의 잔기 28-34는 구조적으로 B2 모듈과 상동성이 있으며 sDR5의 CRD1 내 A1 모듈과 타이트 백본(tight backbone) 상호작용을 하는 것을 특징으로 하는 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조
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제 9항에 있어서, TRAIL-sDR5의 중앙 접촉 부위에서 AA" 루프의 잔기 131-135를 포함하여 광범위한 상호작용을 하는 것을 특징으로 하는 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조
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제 9항에 있어서, AA" 루프의 잔기 131-135는 Arg 132의 구아니디노 군이 sDR5의 Tyr 50과 극성 상호작용을 하고 Asn 134와 Thr 135는 각각 sDR5의 Glu 70과 Asn 81과 상호작용하는 것을 특징으로 하는 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조
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TRAIL 단백질의 안정성 또는 활성을 증진시키기 위하여 1) 상기 루프의 아미노산을 변형하되, 다양한 아미노산 사이의 상호작용을 증대시키는 방향, 금속이온의 결합부위 또는 이황화결합을 생성시키는 방향 등으로 변형; 또는 2) 상기 삼량체 경계면 또는 이량체 경계면의 해당 아미노산을 변형하되, 다양한 아미노산 사이의 상호작용을 증대시키는 방향, 금속이온의 결합부위 또는 이 황화결합을 형성시키는 방향으로의 변형을 포함하는 제 9항의 TRAIL-sDR5 결합체의 3차원 구조를 이용하는 재조합 단백질의 제조방법
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