| 1 |
1
헤페스(HEPES), 수크로오스, D-만니톨, 비에스에이(BSA), 이디티에이(EDTA), 류펩틴, 펩스타인 A, 피엠에스에프(PMSF) 및 디티티(DTT)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액
|
| 2 |
2
제1항에 있어서, 상기 용액의 조성은, 2mM 헤페스, 0
|
| 3 |
3
미토콘드리아의 분리에 있어서, 제1항에 기재된 용액을 버퍼로 사용하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 4 |
4
제3항에 있어서, 상기 분리는, 조직의 무게를 측정하여 기록하고, 즉시 제1항의 미토콘드리아 분리용 용액을 첨가하여 피를 제거하는 단계(1); 피가 제거된 조직을 블랜더로 옮기고, 제1항의 미토콘드리아 분리용 용액을 첨가한 다음 갈아주어서 현탁액을 얻는 단계(2); 현탁액을 원심 분리하는 단계(3); 원심분리 후 미토콘드리아를 포함한 상층액을 분리하는 단계(4); 모아진 상층액을 원심분리한 뒤 상층액을 제거하는 단계(5); 상층액이 제거된 펠렛을 제1항의 용액에 재현탁시킨 후, 원심 분리하는 단계(6); 및 원심분리후 상층 펠렛은 제1항의 용액으로 녹여 제거하고, 하층에 강하게 응축된 미토콘드리아 함유 펠렛을 분리하는 단계(7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 5 |
5
제4항에 있어서, 상기 단계(2)에서 첨가되는 제1항의 용액의 양은, 단계(1)에서 측정한 조직 무게의 2배 부피비인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법;
|
| 6 |
6
제4항에 있어서, 상기 단계(2)의 현탁액을 얻기 위해 갈아주는 과정은 4분 간격으로 5번 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 7 |
7
제4항에 있어서, 상기 단계(3)의 원심분리는 1100×g의 속도로 3 분간 수행하고, 상기 단계(5)의 원심분리는 20000×g 속도로 20 분간 수행함을 특징으로 하고, 상기 단계(6)의 원심분리는 20000×g의 속도로 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 8 |
8
제4항에 있어서, 미토플라스트를 제거하기 위해 디지토닌류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 9 |
9
제8항에 있어서, 상기 디지토닌 류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)는, 단계(7)로부터 얻은 펠렛을 제1항의 용액에 재현탁하여 미토콘드리아 용액을 제조하는 단계(가); 디지토닌을 제1항의 용액 중 비에스에이(BSA)를 제외시킨 용액에 녹이고 냉각시켜 디지토닌 용액을 제조하는 단계(나); 냉각된 디지토닌 용액을 상기 단계(가)에서 제조한 미토콘드리아 용액에 첨가 한 후 교반하는 단계(다); 교반 후, 제1항의 용액을 첨가하여 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계(라); 및 상층액이 제거된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하여 다시 원심 분리하여 미토플라스트를 함유하는 펠렛을 제거하고, 미토콘드리아를 함유하는 상층액을 회수하는 단계(마)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 10 |
10
제9항에 있어서, 상기 단계 (나)에서 사용하는 디지토닌은, 그 사용량이 미토콘드리아 단백질 1 g당 0
|
| 11 |
11
제9항에 있어서, 상기 단계(나)에서의 냉각은 4℃로 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 12 |
12
제9항에 있어서, 상기 단계(라)에서의 첨가되는 제1항의 용액의 양은, 단계(7)로부터 얻은 펠렛 무게 대비 3부피비인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 13 |
13
제9항에 있어서, 상기 단계(라)에서의 원심분리는 10000×g의 속도로 10분 간 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 14 |
14
제4항에 있어서, 단계(4)에서 상층액이 분리되고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 재균질화하여 원심 분리함으로써, 미토콘드리아를 함유하고 있는 상층액을 분리하는 단계(a); 상기에서 분리된 상층액을 원심 분리하는 단계(b); 원심분리 후 회수된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하고 원심분리하는 단계(c); 원심분리 후 회수된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 원심분리한 다음 상층액을 버리는 단계(d); 및 상층액을 버리고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 원심분리하는 단계(e)로부터 회수한 상층액을 상기 단계(5)에 기재된 모아진 상층액에 첨가하여 이후의 단계를 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 15 |
15
제14항에 있어서, 상기 단계(b)의 원심분리는 6780×g의 속도로 15분간 수행하고, 상기 단계(c)의 원심분리는 20000×g의 속도로 10분간 수행하고, 상기 단계(d)의 원심분리는 20000×g의 속도로 수행하고, 상기 단계(e)의 원심분리는 3000×g의 속도로 3분간 수행하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 16 |
16
제14항에 있어서, 상기 단계(e)의 원심분리 후, 상층액을 분리하고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하여 원심분리한 후 상층액을 회수하여, 단계(e)의 원심분리로 회수된 상기의 상층액과 혼합하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
|
| 17 |
17
제1항의 용액을 이용하여 제4항의 방법으로 분리한 미토콘드리아 분리 생성물
|
