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포유류 정소로부터 분리한 세포부유액을 배아줄기세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 포유류 생식줄기세포의 체외 분리 및 증식 방법
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제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO)에 우태아혈청(fetal bovine serum), 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 인간 백혈병 억제 인자(human leukemia inhibitory factor), bFGF 및 포스콜린(forskolin)을 첨가한 것을 특징으로 하는 방법
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제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포 배양 배지가 DMEM에 15％ 우태아혈청(fetal bovine serum), 1％ 비필수 아미노산, 10 uM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 1500 U/ml의 인간 백혈병 억제인자(human leukemia inhibitory factor), 4 ng/ml의 bFGF 및 10uM의 포스콜린(forskolin)을 첨가한 것을 특징으로 하는 방법
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제 1항에 있어서, 상기 포유류는 마우스 또는 인간인 것을 특징으로 하는 방법
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제 1항에 있어서, 상기 세포부유액은 포유류로부터 정소 조직을 적출하는 단계 및 상기 정소 조직에 2단계 효소 처리 과정을 수행하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법
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제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포의 배양배지에서 배양된 세포를 효소처리하여 단일세포로 분리한 다음 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 6항에 있어서, 상기 계대배양을 5-7회 하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 6항에 있어서, 상기 효소는 트립신(trypsin)인 것을 특징으로 하는 방법
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제 1항에 있어서, 상기 배아줄기세포의 배양배지에서 배양된 세포를 기계적으로 조각내어 준비된 공급층(feeder layer)에 옮겨 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 10항에 있어서, 상기 준비된 공급층은 배아줄기세포 배양배지에서 배양된 정소내 관주위 세포(peritubular cell)에서 생식줄기세포를 제외하여 준비하는 것을 특징으로 하는 방법
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포유류의 생식줄기세포 및 세르톨리 세포(Sertoli cell)를 칼슘 알지네이트에 의해 캡슐화(encapsulation)하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는 생식줄기세포의 체외 분화 방법
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제 11항에 있어서, 상기 캡슐화된 세포를 관주위 세포(peritubular cell)가 포함되어 있는 포유류 정소 세포와 공동 배양하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 11항에 있어서, 상기 배양은 인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액, 비타민 C, 비타민 E, 레틴산, 레티놀, 피루베이트, 재조합 인간 FSH, 테스토스테론, 항생제-항사상균제(antibiotic-antimycotic; ABAM)(페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B 함유) 및 BCS가 보충된 HEPES-완충 DMEM/F12 배지에서 하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 12항에 있어서, 상기 배양은 인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액, 비타민 C, 비타민 E, 레틴산, 레티놀, 피루베이트, 재조합 인간 FSH, 테스토스테론, 항생제-항사상균제(antibiotic-antimycotic; ABAM)(페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B 함유) 및 BCS가 보충된 HEPES-완충 DMEM/F12 배지에서 하는 것을 특징으로 하는 방법
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제 12항에 있어서, 상기 관주위 세포가 포함된 포유류 정소세포는 정소세포를 우아혈청(bovine calf serum), FSH 및 테스토스테론을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 제조하는 것임을 특징으로 하는 방법
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제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 미분화된 분리된 생식줄기세포
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제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 분화된 분리된 생식줄기세포
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제 16항 또는 제 17항의 생식줄기세포를 개체에 유효량을 투여하는 것을 포함하는 남성 불임 치료 방법
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제 18항에 있어서, 상기 남성 불임이 희소정자증, 무력정자증, 기형정자증 및 무정자증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
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제 19항에 있어서, 상기 무정자증이 비폐색성 무정자증인 것을 특징으로 하는 방법
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제 16항 또는 제 17항의 생식줄기세포를 포함하는 남성 불임 치료용 조성물
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(a) 포유동물로부터 정소조직을 채취하는 단계;(b) 상기 정소조직을 2단계 효소처리하여 세포부유액을 제조하는 단계; 및(c) 상기 세포부유액을 줄기세포 배양배지에서 배양해서 세포군집이 형성되는지 여부로 생식줄기세포 유무를 판별하는 방법
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(a) 포유동물로부터 정소조직을 채취하는 단계;(b) 상기 정소조직을 2단계 효소처리하여 세포부유액을 제조하는 단계;(c) 상기 세포부유액을 줄기세포 배양배지에서 배양하는 단계; 및(d) 상기에서 배양된 생식줄기세포 및 세르톨리 세포(Sertoli cell)를 칼슘 알지네이트에 의해 캡슐화(encapsulation)하여 3차원 배양하여 분화능을 진단하는 방법
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