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사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터로서, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 유전체로부터 분리된 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터로서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DADA_P(D-alanyl-D-alanine ligase_Promoter)와 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM 7 유래의 플라스미드 DNA로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 포함하는 셔틀벡터
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a) 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 균주의 유전체로부터 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터로서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DADA_P(D-alanyl-D-alanine ligase_Promoter) 프로모터 부위를 PCR 방법으로 증폭하여 벡터에 클로닝하는 단계;b) 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM 7 균주로부터 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM 7 유래의 플라스미드 DNA로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 분리하여 pUC19 벡터에 클로닝하는 단계;c) 벡터의 크기를 최적화하기 위하여, 상기 b) 단계에서 제작된 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM 7 유래의 플라스미드 DNA로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 대장균 복제원점 부위, 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자 및 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 PCR 방법으로 각각 증폭하는 단계;d) 상기 c) 단계에서 생성된 각각의 증폭산물을 제한효소 처리 후, 연결시켜 셔틀벡터 pC19를 제작하는 단계;e) 상기 d) 단계에서 제작된 셔틀벡터 pC19에 유산균에서 복제가 가능한 복제인자 영역을 클로닝하기 위해 상기 b) 단계에서 분리된 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM 7 유래의 플라스미드 DNA로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 유산균 복제원점 부위를 PCR 방법으로 증폭하는 단계;f) 상기 e) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 d) 단계에서 제작된 pC19에 연결시켜 pC29를 제작하는 단계;g) 락토바실러스 속 유산균의 선택마커(selection marker)로 사용되는 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 클로닝하기 위해 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 지놈(genome)을 주형으로 하여 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계;h) 상기 g) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 f) 단계에서 제작된 pC29에 연결시켜 pCE29를 제작하는 단계;i) 상기 a) 단계에서 클로닝된 DADA_P 프로모터를 제한효소 처리 후, 상기 h) 단계에서 제작된 pCE29에 연결시켜 pBCE29를 제작하는 단계;j) 유산균의 선택마커로 사용되는 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 클로닝하기 위해 pNZ8008 플라스미드 벡터를 주형으로 하여 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계; 및 k) 상기 j) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 i) 단계에서 제작된 pBCE29에 연결시켜 셔틀벡터를 제작하는 단계; 를 포함하여 구성되는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 a) 단계의 DADA_P 프로모터 부위는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 c) 단계의 대장균 복제원점 부위 및 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 c) 단계의 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 e) 단계의 유산균 복제원점 부위는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 g) 단계의 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제4항에 있어서,상기 j) 단계의 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터의 제조방법
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제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의해서 제조된 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체
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