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불활성화된 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 DNA의 분리 방법(A method for isolating target DNA using inactivated site-specific nuclease)

  • 기술번호 : KST2016005039
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 유전자형 분석 방법에 관한 것으로, 구체적으로 표적 특이적 뉴클레아제 또는 그 변이체를 이용하여 야생형 DNA 또는 특정 유전자형 DNA를 제거하여 돌연변이 등의 변이 또는 유전자형의 차이가 있는 목적하는 소량의 DNA 만을 증폭하거나 농축하여 암의 진단 또는 유전자형 분석을 하는 방법, 및 표적 특이적 뉴클레아제 또는 그 변이체를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법은 기존의 단순한 PCR 후 정상 유전형과 발암 유전형을 인식하는 표적 특이적 뉴클레아제와 반대되는 새로운 패러다임의 방법으로 암의 조기 진단 또는 유사한 유전자형의 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
Int. CL C07K 19/00 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/10 (2006.01)
CPC C12Q 1/686(2013.01) C12Q 1/686(2013.01) C12Q 1/686(2013.01) C12Q 1/686(2013.01) C12Q 1/686(2013.01) C12Q 1/686(2013.01)
출원번호/일자 1020150075203 (2015.05.28)
출원인 기초과학연구원, 주식회사 툴젠
등록번호/일자
공개번호/일자 10-2015-0138075 (2015.12.09) 문서열기
공고번호/일자 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보 대한민국  |   1020140064526   |   2014.05.28
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2015.05.28)
심사청구항수 45

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 주식회사 툴젠 대한민국 서울특별시 금천구
2 기초과학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 김진수 대한민국 서울특별시 관악구
2 정의환 대한민국 서울특별시 관악구
3 김석중 대한민국 서울특별시 서초구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 유미특허법인 대한민국 서울특별시 강남구 테헤란로 ***, 서림빌딩 **층 (역삼동)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 기초과학연구원 대전광역시 유성구
2 주식회사 툴젠 서울특별시 금천구
번호, 서류명, 접수/발송일자, 처리상태, 접수/발송일자의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 행정처리 표입니다.
번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2015.05.28 수리 (Accepted) 1-1-2015-0515924-17
2 [출원인변경]권리관계변경신고서
[Change of Applicant] Report on Change of Proprietary Status		 2015.06.30 수리 (Accepted) 1-1-2015-0636409-75
3 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2016.11.08 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0803925-77
4 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)		 2017.01.06 수리 (Accepted) 1-1-2017-0019547-86
5 [대리인선임]대리인(대표자)에 관한 신고서
[Appointment of Agent] Report on Agent (Representative)		 2017.01.26 수리 (Accepted) 1-1-2017-0096823-11
6 [지정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
[Designated Period Extension] Application of Period Extension(Reduction, Progress relief)		 2017.02.06 수리 (Accepted) 1-1-2017-0123099-95
7 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2017.03.08 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2017-0233633-79
8 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2017.03.08 수리 (Accepted) 1-1-2017-0233632-23
9 거절결정서
Decision to Refuse a Patent		 2017.07.28 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2017-0530469-67
10 [법정기간연장]기간연장(단축, 경과구제)신청서
 2017.08.30 수리 (Accepted) 1-1-2017-0842949-19
11 법정기간연장승인서
 2017.09.01 발송처리완료 (Completion of Transmission) 1-5-2017-0122673-18
12 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2017.09.29 수리 (Accepted) 1-1-2017-0964096-06
13 [명세서등 보정]보정서(재심사)
Amendment to Description, etc(Reexamination)		 2017.09.29 보정승인 (Acceptance of amendment) 1-1-2017-0964097-41
14 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2017.11.07 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2017-0775719-11
15 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2018.01.05 수리 (Accepted) 1-1-2018-0017569-78
16 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2018.01.05 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2018-0017570-14
17 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2018.01.24 수리 (Accepted) 4-1-2018-5013866-16
18 등록결정서
Decision to Grant Registration		 2018.05.25 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2018-0353682-68
19 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2018.10.29 수리 (Accepted) 4-1-2018-5218012-50
번호, 청구항의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 청구항 표입니다.
번호 청구항
1 1
두 종류 이상의 DNA를 포함하는 분리된 시료에서, 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA (gRNA) 및 불활성화된 Cas 단백질 (dCas)을 이용하여 dCas-gRNA-목적하는 DNA의 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 상기 시료로부터 분리하는 단계를 포함하고,상기 불활성화된 Cas 단백질은 DNA 절단 활성이 결여된 것이고,상기 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA는 서로 다른 서열의 2 종류 이상의 sgRNA (single-chain RNA), 또는 서로 다른 세트의 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 2 종류 이상의 이중 RNA (dualRNA)인 것을 특징으로 하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
2 2
삭제
3 3
제1항에 있어서, 상기 방법은 인 비트로 (in vitro)에서 세포-유리 DNA (cell-free DNA)에 적용되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
4 4
제1항에 있어서, 상기 방법은 목적하는 DNA와 gRNA 및 dCas 단백질 간의 가교 공유결합 (cross-link covalent bond)의 형성 없이 수행되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
5 5
제1항에 있어서, 상기 복합체로부터 상기 목적하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
6 6
제1항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 분리를 위한 친화성 태그 (tag)를 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
7 7
제6항에 있어서, 상기 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CBP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3 (softag 3), 스트렙 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그로 이루어진 군에서 선택되는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
8 8
삭제
9 9
제1항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 D10A, H840A 또는 D10A/H840A 돌연변이를 가지는 Cas9 단백질 변이체인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
10 10
제9항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요젠스 (streptococcus pyogens) 유래인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
11 11
제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 태그에 결합하는 친화성 컬럼 또는 자성 비드 (magnetic bead)를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
12 12
제11항에 있어서, 상기 방법에서 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그로서, 상기 His 태그에 결합하는 금속 친화성 컬럼 (metal affinity column) 또는 자성 비드를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
13 13
제12항에 있어서 상기 자성 비드는 Ni-NTA 자성 비드인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
14 14
제5항에 있어서, 상기 복합체로부터 목적하는 DNA의 분리는 RNase 및 단백질 가수분해효소를 이용하여 수행되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
15 15
제1항에 있어서, 상기 방법은 두 종류 이상의 유전자형 DNA가 혼합된 분리된 시료에서 특정 유전자형 DNA를 분리하기 위한 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
16 16
제1항에 있어서, 상기 방법은 두 가지 이상의 목적하는 DNA를 분리할 수 있는 것이고, 상기 두 가지 이상의 목적하는 DNA의 분리는 두 가지 이상의 목적하는 DNA 각각에 특이적인 가이드 RNA를 각각 2 종류 이상 사용하는 것이며,상기 2 종류 이상의 가이드 RNA는 서로 다른 서열의 2 종류 이상의 sgRNA, 또는 서로 다른 세트의 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 2 종류 이상의 이중 RNA인 것인,목적하는 DNA를 분리하는 방법
17 17
삭제
18 18
제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
19 19
제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중RNA (dualRNA)인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
20 20
제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 분리된 RNA 형태이거나, 플라스미드에 코딩되어 있는 형태인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
21 21
유전체 DNA를 포함하는 분리된 시료에서, 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA (gRNA) 및 불활성화된 Cas 단백질 (dCas)을 이용하여 dCas-gRNA-목적하는 DNA의 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 상기 시료로부터 분리하는 단계를 포함하고,상기 불활성화된 Cas 단백질은 DNA 절단 활성이 결여된 것이고,상기 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA는 서로 다른 서열의 2 종류 이상의 sgRNA (single-chain RNA), 또는 서로 다른 세트의 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 2 종류 이상의 이중 RNA (dualRNA)인 것을 특징으로 하는,목적하는 DNA를 분리하는 방법
22 22
삭제
23 23
제21항에 있어서, 상기 방법은 인 비트로 (in vitro)에서 세포-유리 DNA (cell-free DNA)에 적용되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
24 24
제21항에 있어서, 상기 방법은 목적하는 DNA와 gRNA 및 dCas 단백질 간의 가교 공유결합 (cross-link covalent bond)의 형성 없이 수행되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
25 25
제21항에 있어서, 상기 방법은 상기 복합체로부터 목적하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
26 26
제21항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 분리를 위한 친화성 태그 (tag)를 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
27 27
제26항에 있어서, 상기 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CBP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3 (softag 3), 스트렙 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그로 이루어진 군에서 선택되는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
28 28
삭제
29 29
제21항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 D10A, H840A 또는 D10A/H840A 돌연변이를 가지는 Cas9 단백질 변이체인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
30 30
제29항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요젠스 (streptococcus pyogens) 유래인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
31 31
제26항에 있어서, 상기 방법은 상기 태그에 결합하는 친화성 컬럼 또는 자성 비드 (magnetic bead)를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
32 32
제31항에 있어서, 상기 방법에서 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그로서, 상기 His 태그에 결합하는 금속 친화성 컬럼 (metal affinity column) 또는 자성 비드를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
33 33
제32항에 있어서 상기 자성 비드는 Ni-NTA 자성 비드인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
34 34
제25항에 있어서, 상기 복합체로부터 목적하는 DNA의 분리는 RNase 및 단백질 가수분해효소를 이용하여 수행되는 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
35 35
제21항에 있어서, 상기 복합체를 형성하는 단계와 분리하는 단계 사이에, dCas-gRNA-목적하는 DNA의 복합체가 형성된 상기 시료에 뉴클레아제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
36 36
제21항에 있어서, 상기 유전체 DNA를 포함하는 시료는, 가이드 RNA와 불활성화된 Cas 단백질과의 반응 이전에 뉴클라아제를 처리하여 유전체 DNA가 절단된 것인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
37 37
제21항에 있어서, 상기 방법은 유전체 DNA에서 둘 이상의 목적하는 DNA 부위를 분리할 수 있는 것이고,상기 두 가지 이상의 목적하는 DNA의 분리는 상기 두 가지 이상의 목적하는 DNA 각각에 특이적인 가이드 RNA를 각각 2 종류 이상 사용하는 것이며,상기 2 종류 이상의 가이드 RNA는 서로 다른 서열의 2 종류 이상의 sgRNA, 또는 서로 다른 세트의 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 2 종류 이상의 이중 RNA인 것인,목적하는 DNA를 분리하는 방법
38 38
삭제
39 39
제21항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA) 또는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중RNA (dualRNA)인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
40 40
제21항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 분리된 RNA 형태이거나, 플라스미드에 코딩되어 있는 형태인, 목적하는 DNA를 분리하는 방법
41 41
(i) 두 가지 이상의 유전자형 DNA가 혼합된 분리된 시료에 특정 유전자형 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA (gRNA) 및 불활성화된 Cas 단백질 (dCas)을 처리하여 dCas-gRNA-특정 유전자형 DNA의 복합체를 형성하고 상기 복합체를 상기 시료로부터 분리하고, 상기 복합체로부터 특정 유전자형 DNA를 분리하는 단계; 및(ii) 상기 (i) 단계에서 분리된 특정 유전자형 DNA를 분석하는 단계를 포함하고,상기 불활성화된 Cas 단백질은 DNA 절단 활성이 결여된 것이고,상기 특정 유전자형 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA는 서로 다른 서열의 2 종류 이상의 sgRNA (single-chain RNA), 또는 서로 다른 세트의 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 2 종류 이상의 이중 RNA (dualRNA)인 것을 특징으로 하는, 유전자형 분석 방법
42 42
제41항에 있어서, 상기 분석하는 단계는 (b) 상기 (i) 단계에서 분리된 특정 유전자형 DNA를 증폭하는 단계; 및(c) 상기 증폭된 특정 유전자형 DNA를 분석하는 단계를 포함하여 수행하는 것인, 유전자형 분석 방법
43 43
제42항에 있어서,상기 특정 유전자형 DNA는 암 특이적인 돌연변이를 포함하는 DNA이며, 상기 특정 유전자형 DNA를 분석하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한, 유전자형 분석 방법
44 44
삭제
45 45
제43항에 있어서, 상기 암의 진단은 암의 초기 진단인 것인 유전자형 분석 방법
46 46
제43항에 있어서, 상기 암의 진단은 암의 예후를 예측하는 것인 유전자형 분석 방법
47 47
삭제
48 48
제41항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 분리를 위한 친화성 태그 (tag)를 포함하는, 유전자형 분석 방법
49 49
제48항에 있어서, 상기 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CBP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3 (softag 3), 스트렙 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그로 이루어진 군에서 선택되는, 유전자형 분석 방법
50 50
삭제
51 51
제41항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 D10A/H840A 돌연변이를 가지는 Cas9 단백질 변이체인, 유전자형 분석 방법
52 52
제51항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 스트렙토코커스 피요젠스 (streptococcus pyogens) 유래인 것인, 유전자형 분석 방법
53 53
제48항에 있어서, 상기 방법은 상기 태그에 결합하는 친화성 컬럼 또는 자성 비드 (magnetic bead)를 이용하여 특정 유전자형 DNA를 분리하는 것인, 유전자형 분석 방법
54 54
제41항에 있어서, 상기 상기 복합체로부터 특정 유전자형 DNA의 분리는 RNase 및 단백질 가수분해효소를 이용하여 수행되는 것인, 유전자형 분석 방법
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3 JP29516500 JP 일본 FAMILY
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6 WO2015183025 WO 세계지적재산권기구(WIPO) FAMILY
7 WO2015183026 WO 세계지적재산권기구(WIPO) FAMILY

DOCDB 패밀리 정보

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3 EP3150718 EP 유럽특허청(EPO) DOCDBFAMILY
4 JP2017516500 JP 일본 DOCDBFAMILY
5 KR101815695 KR 대한민국 DOCDBFAMILY
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7 US2017191123 US 미국 DOCDBFAMILY
8 WO2015183025 WO 세계지적재산권기구(WIPO) DOCDBFAMILY
9 WO2015183026 WO 세계지적재산권기구(WIPO) DOCDBFAMILY
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