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ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5'-아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 7과 프레임에 맞게 연결된 F2A 및치료용 단백질(therapeutic protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; ⅲ) 양성 선별마커; 및 ⅳ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3'-아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는, 형질전환 소에서의 외래 단백질 생산용 넉-인(knock in) 벡터
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제1항에 있어서,상기 치료용 단백질은 인간 엔도스타틴(endostatin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), G-CSF(granulocyte colony stimulating factor), 혈액응고인자(blood coagulation factor) 또는 인간 성장 호르몬(human growth hormone)인, 넉-인 벡터
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제2항에 있어서, 상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 넉-인 벡터
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제3항에 있어서, 상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자의 3'-말단에 BGH(bovine growth hormone) polyA 신호가 추가로 연결된, 넉-인 벡터
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제4항에 있어서, 상기 BGH polyA 신호는 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 넉-인 벡터
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제1항에 있어서, 상기 양성 선별마커는 neo 유전자, puromycin 저항성 유전자 또는 Zeocin 저항성 유전자인, 넉-인 벡터
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제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 넉-인 벡터로 형질감염된 소 체세포 중 베타-카제인을 암호화하는 게놈 DNA 상에 상기 넉-인 벡터에 포함되어 있는 유전자 컨스트럭트가 제대로 넉-인된 형질전환 소 체세포를 선별하는 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계;상기 소 체세포의 핵을 소 난자의 핵과 치환하여, 핵치환 난자를 제조하는 소 난자 핵치환 단계;상기 핵치환 난자를 발생시켜 형질전환 넉-인 소를 제조하는 형질전환 넉-인 소 제조단계; 및상기 넉-인 소 중 암소를 사육하여 우유로부터 상기 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 형질전환 넉-인 소로부터 외래단백질의 생산방법
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제9항에 있어서,상기 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계는ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호 24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하고, 상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별한 후, 상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하여, 이를 주형으로 하여 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 반응을 수행한 후, 상기 1차 PCR 반응에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 반응 수행한 뒤, 상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별함으로써 수행되는, 생산방법
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제10항에 있어서,상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 생산방법
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ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계;상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계;상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;상기 게놈 DNA를 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 단계; 상기 1차 PCR에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 단계; 및상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별하는 단계를 포함하는, 상기 넉-인 벡터가 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역에 제 위치로 삽입됨으로써 소 베타-카제인 발현이 넉-아웃 되지 않고, 인간 엔도스타틴이 발현되는 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법
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제12항에 있어서,상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 선별방법
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제12항에 있어서,상기 제1센스 프라이머는 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되고, 상기 제1안티센스 프라이머는 서열번호 19으로 기재되는 핵산서열로 구성되며, 상기 제2센스 프라이머는 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되고, 상기 제2안티센스 프라이머는 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는, 선별방법
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서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1센스 프라이머; 서열번호 19로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1안티센스 프라이머; 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2센스 프라이머; 및 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2안티센스 프라이머를 포함하는 소 베타-카제인의 발현이 넉-아웃되지 않고 소 베타-카제인 단백질과 인간 엔도스타틴 단백질이 융합된 형태로 발현되도록 형질전환된, 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별용 키트
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제12항의 선별방법에 의해 선별된 베타-카제인 게놈 DNA로 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자가 넉-인되고, 상기 베타-카제인을 암호화하는 유전자는 넉-아웃이 되지 않은 넉-인 형질전환 소 체세포
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소의 난자의 핵을 제16항의 형질전환 소 체세포의 핵으로 치환시켜 제조된 핵치환 난세포를 발생시켜 태어난, 인간 엔도스타틴를 우유로 분비하는 형질전환 복제소
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ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호 24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계; 및상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계를 포함하는, 넉-인 형질전환 체세포의 제조방법
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제18항에 있어서,상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 제조방법
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