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줄기세포로부터 신경전구세포를 형성한 다음, 상기 신경전구세포를 콜린성 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 콜린성 신경세포의 생산방법으로서,상기 콜린성 신경세포의 생산방법은(a) SHH(Sonic Hedgehog)를 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 배양하여 배아유사세포 덩어리(embryoid body)를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 배아유사세포 덩어리를 SHH를 포함하는 로제트 형성용 배지에서 배양하여 로제트를 수득한 다음, 상기 로제트를 SHH를 포함하는 배지에서 배양하여 신경구세포(neurosphere)를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 신경구세포를 배양하여 신경전구세포를 수득하는 단계; 및(d) 상기 수득한 신경전구세포를 콜린성 신경세포 분화용 배지에서 배양하여 콜린성 신경세포를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포인 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 (a) 단계는 줄기세포를 DMEM/F12 배지 또는 KO-DMEM/F12 배지에서 배양하는 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 (b) 단계는 8 내지 20일 동안 수행되는 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 (b) 단계에서 배아유사세포 덩어리를 N2, B27, bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 SHH를 포함하는 로제트 형성용 배지에서 배양하여 로제트를 수득한 다음, 상기 로제트를 배양하여 신경구세포를 수득하는 것인 방법
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제8항에 있어서,상기 로제트 형성용 배지는 N2, B27, bFGF 및 SHH를 포함하는 DMEM/F12 배지 또는 KO-DMEM/F12 배지인 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 (c) 단계에서 신경구세포를 무혈청 배지에서 배양하여 신경전구세포를 수득하는 것인 방법
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제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에 콜린성 신경세포 분화용 배지는 Glutamax, B27, EGF, 헤파린, 아스코빈산, BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 방법
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제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 (d1) 신경전구세포를 콜린성 신경세포 분화용 배지에서 배양하여 콜린성 신경세포를 생성하는 단계; (d2) 상기 배지에 분화억제 물질을 처리하여, 콜린성 신경세포 이외의 다른 종류의 신경세포의 증식을 억제하는 단계; 및 (d3) 상기 배지에 성장인자를 처리하여, 콜린성 신경세포를 증식하는 단계를 포함하는 것인 방법
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제12항에 있어서, 상기 (d2) 단계는 1 내지 5일 동안 수행되고, 상기 분화억제 물질은 시타라빈(cytarabine, AraC)인 것인 방법
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제12항에 있어서,상기 (d3) 단계는 (d) 단계의 시작 시점으로부터 4 내지 15일이 경과된 후에 수행되고, 상기 성장인자는 bFGF 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 콜린성 신경세포의 생산방법은 (a') 줄기세포를 1 내지 10일 동안 배양하여 배아유사세포 덩어리를 수득하는 단계; (b') 상기 수득한 배아유사세포 덩어리에 SHH를 처리하면서 4 내지 10일 동안 배양하여 로제트를 수득하는 단계; (c') 상기 수득한 로제트에 SHH를 처리하면서 4 내지 10일 동안 배양하여 신경구세포를 수득하는 단계; (d') 상기 수득한 신경구세포를 1 내지 5일 동안 배양하여 신경전구세포를 수득하는 단계; (e') 상기 수득한 신경전구세포를 콜린성 신경세포 분화용 배지에서 3 내지 10일 동안 배양하여 콜린성 신경세포를 생성시키는 단계; (f') 상기 배지에 시타라빈을 처리하고 1 내지 5일 동안 배양하여, 콜린성 신경세포 이외의 다른 종류의 신경세포의 증식을 억제하는 단계; 및 (g') 상기 배지에 bFGF를 처리하고 10 내지 30일 동안 배양하여, 콜린성 신경세포를 증식하는 단계를 포함하는 것인 방법
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