| 1 |
1
(a) R6K ori, mob RP4 유전자, cat 유전자, sacB 유전자 및 평활말단으로 절단되는 제한효소 절단부위를 포함하는 다클론부위를 포함하고, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 포함하지 않는 자살벡터의 다클론부위에 DNA 삽입단편이 도입된 재조합벡터를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 재조합벡터를 다제내성 균주에 도입하여, 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하여 표적 유전자가 결실된 변이주를 선발하는 단계를 포함하는, 다제내성 균주의 변이주 제작방법
|
| 2 |
2
제1항에 있어서,(a) 단계의 자살벡터는 다제내성 균주에서 복제되지 않는 특성을 나타내는 것인 방법
|
| 3 |
3
제1항에 있어서,(a) 단계의 자살벡터는 도 1b에 도시된 개열지도를 갖는 것인 방법
|
| 4 |
4
제1항에 있어서,(a) 단계의 자살벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법
|
| 5 |
5
제1항에 있어서,(a) 단계의 DNA 삽입단편은 다제내성 균주의 게놈 DNA에 위치한 표적 유전자의 상류에 인접한 염기서열, 상기 표적 유전자의 하류에 인접한 염기서열 및 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제에 대한 저항성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 순차적으로 포함하는 것인 방법
|
| 6 |
6
제1항에 있어서,(b) 단계의 다제내성 균주는 아시네토박터 바우마니 균주(Acinetobacter baumannii)인 것인 방법
|
| 7 |
7
제1항에 있어서,(b) 단계의 형질전환체의 수득은 재조합벡터가 도입된 다제내성 균주를 다제내성 균주가 저항성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하는 균주를 선별하여 수행하는 것인 방법
|
| 8 |
8
제1항에 있어서,(c) 단계의 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1) 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 내성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2) 상기 선발된 균주로부터 게놈 DNA를 수득하고 그의 크기를 야생형 다제내성 균주의 게놈 DNA의 크기와 비교하여, 상기 게놈 DNA의 크기가 감소된 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하는 것인 방법
|
| 9 |
9
제1항에 있어서,(c) 단계의 표적 유전자가 결실된 변이주의 선발은 (c1') 수크로스를 포함하는 배지에서 배양된 형질전환체를 다제내성 균주가 내성을 나타내지 않은 항생제가 포함된 배지에서 배양하고, 생존하지 않는 균주를 선발하는 단계; 및, (c2') 상기 선발된 균주에서 나타나는 표적 유전자의 활성을 측정하여, 야생형 다제내성 균주에서 측정된 표적 유전자의 활성보다 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 균주를 선별하는 단계에 의하여 수행하는 것인 방법
|
| 10 |
10
제1항에 있어서,다제내성 균주에 존재하는 다른 표적 유전자를 추가로 결실시키기 위하여, (a) 내지 (c) 단계를 반복수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법
|
| 11 |
11
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되어 다제내성 균주의 표적 유전자가 결실된 변이주
|
