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(a) 분리된 유전체 (genomic) DNA를 표적 특이적 유전자 가위 (programmable nuclease)로 절단하는 단계;(b) 상기 절단된 DNA에 대한 전체 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing)을 수행하는 단계; 및(c) 상기 시퀀싱으로 수득한 염기서열 데이터 (sequence read)에서 상기 절단된 위치를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 절단된 위치는 수득한 염기서열 데이터 (sequence read)를 정렬하여 5' 말단이 수직 정렬된 위치, 또는 5' 말단 플롯에서 이중 피크 패턴을 보이는 위치인,유전자 가위의 비표적 위치 (off-target site)를 검출하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 절단된 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 유전체 DNA는 표적 특이적 유전자 가위가 발현되는 세포 또는 발현되지 않는 세포로부터 분리된 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 정렬은 표준 염기서열 (reference genome)로 염기서열 데이터를 맵핑한 뒤, BWA/GATK 또는 ISAAC을 이용하여 수행되는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand)에 해당하는 염기서열 데이터 (sequence read)가 각각 두 개 이상씩 수직으로 정렬되는 위치를 비표적 위치인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 20 % 이상의 염기서열 데이터가 수직으로 정렬되고, 각각의 왓슨 가닥 및 크릭 가닥에서 동일한 5' 말단을 가진 염기서열 데이터의 수가 10 이상인 위치가 비표적 위치인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 분리된 유전체 DNA는 유전자 가위가 발현된 세포로부터 분리된 것이고, 상기 DNA의 비표적 위치에서 인델 (Insertion and deletion)을 확인하여 비표적 효과를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제8항에 있어서, 상기 인델을 확인하는 것은 상기 비표적 위치에 대한 T7E1 분석, Cel-I 효소를 이용한 돌연변이 검출 분석 또는 표적화 딥시퀀싱 (targeted deep sequencing)을 수행하여 이루어지는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 비표적 위치는 표적 위치와 1 개 이상의 뉴클레오티드 불일치 (mismatch)를 가지는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 비표적 위치는 표적 위치와 1 내지 6 개의 뉴클레오티드 불일치 (mismatch)를 가지는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 절단된 각각의 위치에 하기 식을 적용하여 절단 점수를 산출하여 수행되는 것인, 유전자 가위의 비표적 위치 (off-target site)를 검출하는 방법
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제12항에 있어서, 상기 식에서 상수 C가 100일 때 산출된 점수가 25,000 점 이상인 경우 비표적 위치로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 유전자 가위는 2 개 이상의 표적에 대한 유전자 가위를 혼합한 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 유전자 가위는 2 내지 100 개의 표적에 대한 유전자 가위를 혼합한 것인, 방법
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제14항에 있어서, 표적 위치와의 편집 거리 (edit distance)에 따라 비표적 위치를 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항에 있어서, 상기 유전자 가위는 메가뉴클레아제 (meganuclease), ZFN (zinc finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), RGEN (RNA-guided engineered nuclease) 및 Cpf1으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법
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제17항에 있어서, 상기 RGEN은 표적 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA (dualRNA) 또는 단일-사슬 가이드 RNA 형태인 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체인 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속 및 캄필로박터 (Campylobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 유래인 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, Pi-PspI 및 Pi-SceI로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법
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제18항에 있어서, 상기 Cpf1은 캔디다투스 파세이박터 (Candidatus Paceibacter), 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 유래인 것인, 방법
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플라스미드 (plasmid)를 주형으로 하여 시험관 내 (in vitro) 전사된 가이드 RNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 유전체 교정에서 비표적 효과를 감소시키는 방법
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제25항에 있어서, 상기 비표적 효과 감소는, 벌지-형 (bulge-type) 비표적 위치에 인델이 발생하는 것을 막는 것에 의한 것인, 방법
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