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1) 시반세포 위에 운동 뉴런 세포를 시딩하는 단계; 및2) 운동 뉴런 세포와 시반세포를 공동배양하는 단계;를 포함하고,상기 1) 단계이전에 시반세포를 마트리겔(matrigel)로 코팅된 고체 또는 겔 배지 위에 시딩한 후 6일 이상 배양하는 단계를 더 포함하는 생체외(in vitro)에서 운동 뉴런을 배양하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 시반세포의 배양은 6일 내지 10일 동안 수행되는 방법
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제1항에 있어서, 상기 시반세포의 배양은 제1배지 및 제2배지 중 하나 이상을 첨가하여 수행하는 것이고,상기 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 포스콜린(forskolin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이고;상기 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법
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제5항에 있어서,상기 1배지는 무수염화칼슘(calcium chloride anhydrous), 덱스트로오스, 질산제2철 9수화물(ferric nitrate nonahydrate), 무수 황산 마그네슘(magnesium sulfate anhydrous), 염화칼륨(potassium chloride), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 염화나트륨(sodium chloride), L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(L-arginine monohydrochloride), 글라이신(glycine), L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate), L-이소루신(L-isoleucine), L-루신(L-leucine), L-라이신 모노하이드로클로라이드(L-lysine monohydrochloride), L-메티오닌(L-methionine), L-페닐알라닌(L-phenylalanie), L-세린(L-serine), L-트레오닌(L-threonine), L-트립토판(L-tryptophan), L-발린(L-valine), D-판토텐산 칼슘(D-calcium pantothenate), 염화콜린(choline chloride), 엽산(folic acid), I-이노시톨(I-inositol), 나이아신 아미드(niacinamide), 피리독신 모노하이드로클로라이드(pyridoxine monohydrochloride), 리보플라빈(riboflavin), 티아민 모노하이드로클로라이드(thiamine monohydrochloride), 피브루산 나트륨염(pyruvic acid sodium salt), L-티로신 디소디움염 디하이드레이트(L-tyrosine disodium salt, dehydrate), L-시스틴 디하이드로클로라이드(L-cystine dihydrochloride), 무수 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, anhydrous)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법
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제5항에 있어서,상기 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것인 방법
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제5항에 있어서,상기 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0
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제5항에 있어서,상기 제2배지는 제2배지의 총부피에 대해 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30μg/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함하는 것인 방법
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제5항에 있어서,상기 시반세포의 배양은 시반세포를 시딩한 후에 제1배지를 첨가하여 배양하는 방법
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제10항에 있어서,상기 시반세포의 배양은 제1배지의 첨가 후, 3일 내지 5일 째에 제1배지를 제2배지로 교체하여 배양하는 방법
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제1항에 있어서,상기 시반세포의 배양은 배지 위에 1x104 내지 5x104 의 세포수를 올리고, 35 내지 40℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 방법
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제1항에 있어서,상기 1)운동 뉴런을 시딩하는 단계는 시반세포의 세포층(cell layer)위에 운동 뉴런을 시딩하는 방법
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제1항에 있어서,상기 1)단계에서 시딩되는 운동 뉴런은 3x103 내지 1x104개의 세포수인 방법
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제1항, 제4항 및 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,상기 2)단계는 제3배지 및 제4배지 중 하나 이상을 첨가하여 운동 뉴런과 시반세포를 공동배양 하고,상기 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27？？ 무혈청 서플먼트(B-27？？ serum-free supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이고;상기 제4배지는 제 3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것인 방법
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제15항에 있어서,상기 제3배지는 글라이신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라진-H2O, L-시스테인, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소루신, L-루신, L-라이신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알리닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, 나이아신 아미드, 염산 피리독신(Pyridoxal hydrochloride), 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, I-이소시톨, 무수 염화칼슘, 질산제2철 9수화물, 무수 염화 마그네슘, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산수소나트륨, 황산아연, 덱스트로오스, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 페놀레드, 소디움 피루베이트(Sodium Pyruvate)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법
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제15항에 있어서,상기 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27？？ 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것인 방법
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제15항에 있어서,상기 제3배지는 0
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제15항에 있어서,상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것인 방법
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제15항에 있어서,상기 2)단계는 운동 뉴런을 시반세포 위에 시딩 한 후에 제3배지를 첨가하여 배양하는 방법
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제20항에 있어서,상기 2)단계는 제 3배지를 첨가하여 배양 후 5일 내지 9일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 방법
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제1항에 있어서,상기 2)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 방법
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제1항에 있어서,상기 2) 단계의 공동배양은 5일 내지 40일 동안 수행하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 2)단계의 공동배양은 2일 내지 4일 주기로 배지의 50%를 교체하고 35℃ 내지 40℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 방법
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제1항에 있어서,상기 방법은 2) 단계 이후에 3)공동 배양으로 시반세포가 운동 뉴런의 수초(myelin)를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법
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제25항에 있어서,상기 방법은 3) 단계 이후에 수초가 형성된 운동 뉴런을 수득하는 단계를 더 포함하는 방법
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제1항에 있어서,상기 시반세포의 배양은 커버슬립(coverslip) 또는 배양디쉬(culture dish)에서 수행되는 것인 방법
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제1항에 있어서,상기 운동 뉴런 세포는 운동 뉴런 질환(Motor neuron disease)을 가지는 개체로부터 수득된 것인 방법
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제28항에 있어서,상기 운동 뉴런 질환은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 및 가족성 운동 뉴런 질환(Familial motor neuron disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법
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제28항에 있어서,상기 개체는 포유류인 방법
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마트리겔(matrigel)로 코팅된 고체 또는 겔 배지; 및제3배지, 및 제4배지를 포함하고,상기 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27？？ 무혈청 서플먼트(supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 것이고;상기 제4배지는 제3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것이며,제1항, 제4항 및 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 생체 외에서 운동 뉴런을 배양하는 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는, 운동 뉴런의 배양키트
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제31항에 있어서,상기 고체 또는 겔 배지는 제1배지 및 제2배지를 포함하고,상기 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 의 포스콜린(forskolin)를 포함하는 것이고;상기 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물을 더 포함하는 것인 운동신경의 배양키트
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제31항에 있어서,상기 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27？？ 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것인 배양키트
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제31항에 있어서,상기 제3배지는 0
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제31항에 있어서,상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것인 배양키트
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제32항에 있어서,상기 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것인 배양키트
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제32항에 있어서,상기 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0
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제32항에 있어서,상기 제2배지는 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30ng/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함하는 것인 배양키트
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제31항에 있어서,상기 키트는 코엔자임 Q10을 더 포함하고;상기 설명서는 4) 단계에서 공동-배양 시 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양한다는 내용이 기재된 배양키트
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