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(a) 말초혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 EGM-2MV(Microvascular Endothelial Cell Growth Media-2) 배지에 현탁하여 씨딩(seeding)한 후, 5 내지 8일 동안 매일 배지를 교환하면서 T세포를 제거하여 배양함으로써 심장내막 유래 성체줄기세포를 수득하는 단계;(b) 심장내막 유래 성체줄기세포에 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), c-MYC(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), OCT4(Octamer-binding transcription factor 4), 및 KLF4(Kruppel-like factor 4) 유전자를 도입하는 단계;(c) 상기 유전자가 도입된 세포를 EGM-2MV(Microvascular Endothelial Cell Growth Media-2) 배지로 8 내지 12일 동안 매일 교환하면서 배양하여 상피세포 유사 세포를 얻는 단계; 및(d) 상기 세포를 지지세포 위로 올리고 EGM-2MV 배지로 3 내지 7일 동안 배양 후 ES(Embryonic stem cell) 배지로 교환하는 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포의 제조방법으로서,상기 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포는 심장내막 기원을 가지는바, 높은 효율로 심혈관계 세포로 분화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법
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제1항에 있어서,상기 지지세포는 마우스 유래 배아 섬유아세포주인 것을 특징으로 하는, 제조방법
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제1항에 있어서,상기 ES 배지는 넉아웃 혈청 대체제(knockout serum replacement), L-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산(non essential amino acids), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 및 bFGF가 처리된 DMEM/f12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)인 것을 특징으로 하는, 제조방법
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하기의 단계를 포함하는, 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포로부터 내피세포로의 분화방법:(a) 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중내배엽세포(mesoendodermal cell)로 분화시키는 단계;(b) 상기 중내배엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 Akt(Protein kinase B; PKB) 억제제를 처리하여 중배엽세포(mesoblast cell)로 분화시킨 후 성장인자를 처리하고 매일 배지를 교환하며 7 내지 10일 동안 배양하여 CD34 양성세포를 얻는 단계; 및(c) 상기 CD34 양성세포에 상기 성장인자를 재처리하고 매일 배지를 교환하면서 10 내지 20일 동안 계대배양하는 단계
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제7항에 있어서,상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법
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제7항에 있어서,상기 Akt 억제제는 PD98059(2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법
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제7항에 있어서, 상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 bFGF(Basic fibroblast growth factor)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법
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하기의 단계를 포함하는, 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포로부터 평활근세포로의 분화방법:(a) 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중내배엽세포(mesoendodermal cell)로 분화시키는 단계;(b) 상기 분화된 중내배엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 PI3K(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) 억제제를 처리하고 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및(c) 상기 배양된 중내배엽세포에 성장인자를 처리하고 12 내지 16일 동안 계대배양하는 단계
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제12항에 있어서,상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법
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제12항에 있어서, 상기 PI3K 억제제는 LY294002(2-(4-morpholino)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법
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제12항에 있어서,상기 성장인자는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB) 및 TGF-β(Transforming growth factor-beta)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법
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하기의 단계를 포함하는, 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화방법:(a) 제1항의 제조방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포를 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 비타민 C, 액티빈 A(Activin A), 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 중배엽세포(mesoblast cell)로 분화시키는 단계;(b) 상기 분화된 중배엽세포를 BMP4, 성장인자, 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 첨가된 배지에서 2 내지 4일 동안 배양하는 단계; 및(c) 상기 배양된 세포를 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하고 Wnt(Wingless-type MMTV integration site family) 신호전달 억제제를 첨가하여 1 내지 3일 동안 배양한 후, 인슐린을 함유하는 B27 보충제가 포함된 배지에서 추가 배양하는 단계
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제17항에 있어서, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법
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제17항에 있어서,상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법
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제17항에 있어서,상기 Wnt 신호전달 억제제는 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법
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