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(1) 아미노산 변이를 포함하는 제1 CH3 도메인을 포함하는 효모 세포 표면 발현 벡터 및 아미노산 변이를 포함하는 제2 CH3 도메인을 포함하는 효모 세포 외 분비 벡터를 준비하는 단계;(2) 상기 단계 (1)의 벡터를 접합타입이 다른 효모에 각각 형질감염시키는 단계;(3) 상기 단계 (2)의 효모접합 타입이 다른 두 효모를 효모접합하여 효모 표면에 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc)를 형성시키는 단계; 및(4) 상기 단계 (3)의 접합된 효모 표면에 형성된 이종이중체 중쇄불변부위에서 효모 세포 외 분비 벡터에 포함된 제2 CH3 도메인을 탐지하는 단계를 포함하는,항체 CH3 도메인의 이종이중체 형성 평가 방법
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청구항 1에 있어서, 항체 CH3 도메인의 이종이중체는 하기의 변이를 포함하는 것인, 방법
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제1 CH3 도메인을 포함하는 효모 세포 표면 발현 벡터 및 제2 CH3 도메인을 포함하는 효모 세포 외 분비 벡터를 접합타입이 다른 효모에 각각 형질감염시키고, 두 효모를 접합하여 접합된 효모세포 표면에 생성되는 하기의 변이를 포함하는 항체 CH3 도메인의 이종이중체 라이브러리:(A1) 제1 CH3 도메인의 K370 위치에서의 글루탐산 (E), 메티오닌 (M) 또는 아스파르트산 (D)으로의 치환; 및 제2 CH3 도메인의 E357 위치에서의 아스파라진 (N), 이소류신 (I) 또는 메티오닌 (M)으로의 치환 및/또는 S364 위치에서의 트레오닌 (T) 또는 트립토판 (W)으로의 치환; 또는(B1) 제1 CH3 도메인의 D399 위치에서의 글루탐산 (E) 또는 류신 (L)으로 의 치환; 및 제2 CH3 도메인의 K392 위치에서의 글루탐산 (E), 세린 (S) 또는 글리신 (G)으로의 치환 및/또는 K409 위치에서의 류신 (L) 또는 메티오닌 (M)으로의 치환
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하기의 단계를 포함하는 이종이중체 중쇄불변부위의 형성이 선호되는 CH3 도메인 변이체 (heterodimeric CH3) 쌍의 선별 및 제조 방법:(1') 제1 CH3 도메인의 K370 위치에서 글루탐산 (E), 메티오닌 (M) 또는 아스파르트산 (D)으로 치환하고, 제2 CH3 도메인의 E357 위치에서 아스파라진 (N), 이소류신 (I) 또는 메티오닌 (M)으로 치환 및/또는 S364 위치에서 트레오닌 (T) 또는 트립토판 (W)으로 치환하는 단계; 또는(1'') 제1 CH3 도메인의 D399 위치에서 글루탐산 (E) 또는 류신 (L)으로 치환하고, 제2 CH3 도메인의 K392 위치에서 글루탐산 (E), 세린 (S) 또는 글리신 (G)으로 치환 및/또는 K409 위치에서 류신 (L) 또는 메티오닌 (M)으로 치환하는 단계; 및(2) 상기 제1 CH3 도메인 돌연변이 라이브러리를 포함하는 효모 세포 표면 발현 벡터 및 제2 CH3 도메인 돌연변이 라이브러리를 포함하는 효모 세포 외 분비 벡터를 접합타입이 다른 효모에 각각 형질전환한 후에, 두 효모의 접합을 통해 효모세포 표면에 이종이중체 중쇄불변부위 라이브러리를 발현하는 단계 후에, 제2 CH3 도메인을 탐지하여 이종이중체 중쇄불변부위의 형성이 선호되는 CH3 도메인 변이체 (heterodimeric CH3) 쌍을 선별하는 제조 방법
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하기의 변이를 포함하는 항체 CH3 도메인의 이종이중체:(A1-1) 제1 CH3 도메인의 K370은 글루탐산 (E)으로, 제2 CH3 도메인의 E357은 아스파라진 (N)으로 치환;(A1-2) 제1 CH3 도메인의 K370은 글루탐산 (E)으로, 제2 CH3 도메인의 E357은 이소류신 (I)으로, S364는 트레오닌 (T)으로 치환;(A1-3) 제1 CH3 도메인의 K370은 메티오닌 (M)으로, 제2 CH3 도메인의 E357은 메티오닌 (M)으로, S364는 트립토판 (W)으로 치환; 또는(A1-4) 제1 CH3 도메인의 K370은 아스파르트산 (D)으로, 제2 CH3 도메인의 E357은 메티오닌 (M)으로 치환; 또는(B1-1) 제1 CH3 도메인의 D399는 글루탐산 (E)으로, 제2 CH3 도메인의 K392는 글루탐산 (E)으로 치환; (B1-2) 제1 CH3 도메인의 D399는 류신 (L)으로, 제2 CH3 도메인의 K392는 세린 (S)으로, K409는 류신 (L)으로 치환; 또는(B1-3) 제1 CH3 도메인의 D399는 류신 (L)으로, 제2 CH3 도메인의 K392는 글리신 (G)으로, K409는 메티오닌 (M)으로 치환
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청구항 5에 있어서, (A1-1) 내지 (A1-4)의 이종이중체는 하기의 변이를 추가로 포함하는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체:제1 CH3 도메인의 K409의 트립토판 (W)으로 치환; 및제2 CH3 도메인의 D399의 발린(V)으로, F405의 트레오닌 (T)으로 치환
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청구항 5에 있어서, (A1-1)의 이종이중체는 하기의 변이를 추가로 포함하는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체:(A2) 제1 CH3 도메인의 E357 및 S364 위치에서의 아미노산의 치환
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청구항 11에 있어서, A2 변이에서 제1 CH3 도메인의 E357은 아스파르트산 (D), 알라닌 (A), 글리신 (G), 또는 아스파라진 (N)으로 치환; 및/또는제1 CH3 도메인의 S364은 트립토판 (W) 또는 타이로신 (Y)으로 치환되는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체
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청구항 12에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 변이를 포함하는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체: (A2-1) 제1 CH3 도메인의 E357은 아스파르트산 (D)으로, 제1 CH3 도메인의 S364는 트립토판 (W)으로 치환;(A2-2) 제1 CH3 도메인의 E357은 알라닌 (A)으로, 제1 CH3 도메인의 S364는 타이로신 (Y)으로, 치환;(A2-3) 제1 CH3 도메인의 E357은 글리신 (G)으로, 제1 CH3 도메인의 S364는 트립토판 (W)으로 치환; 및 (A2-4) 제1 CH3 도메인의 E357은 아스파라진 (N)으로, 제1 CH3 도메인의 S364는 트립토판 (W)으로 치환
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청구항 5에 있어서, (B1-3)의 이종이중체는 하기의 변이를 추가로 포함하는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체:제1 CH3 도메인의 K392 및/또는 K409 위치에서의 아미노산의 치환; 및 제2 CH3 도메인의 D399 위치에서의 아미노산의 치환
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청구항 14에 있어서, 상기 (B1-3)의 이종이중체에서, 제1 CH3 도메인의 K392는 이소류신 (I), 아르기닌 (R), 시스테인 (C), 류신 (L), 세린 (S), 또는 아스파라진 (N)으로 치환; 및/또는 제1 CH3 도메인의 K409는 아르기닌 (R)으로 치환; 및 제2 CH3 도메인의 D399는 글리신 (G), 트립토판 (W), 시스테인 (C), 세린 (S), 또는 발린 (V)으로 치환되는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체
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청구항 14에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 변이를 포함하는 것인, 항체 CH3 도메인의 이종이중체: (B2-1) 제1 CH3 도메인의 K392는 이소류신 (I)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 글리신 (G)으로 치환; (B2-2) 제1 CH3 도메인의 K392는 아르기닌 (R)으로, K409는 아르기닌 (R)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 트립토판 (W)으로 치환; (B2-3) 제1 CH3 도메인의 K392는 시스테인 (C)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 시스테인 (C)으로 치환;(B2-4) 제1 CH3 도메인의 K392는 류신 (L)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 세린 (S)으로 치환;(B2-5) 제1 CH3 도메인의 K392는 세린 (S)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 글리신 (G)으로 치환; 및 (B2-6) 제1 CH3 도메인의 K392는 아스파라진 (N)으로, 제2 CH3 도메인의 D399는 발린 (V)으로 치환
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청구항 5에 있어서, 상기 항체 CH3 도메인의 이종이중체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린의 Fc 부분에 포함되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종이중체
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청구항 17에 있어서, 상기 IgG는 인간 IgG인 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종이중체
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청구항 18에 있어서, 상기 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종이중체
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청구항 5의 CH3 도메인의 이종이중체를 포함하는 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc) 쌍
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청구항 5의 CH3 도메인의 이종이중체를 포함하는, 이중 특이성 항체
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청구항 21에 있어서, 상기 항체는 scFv-Fc, scIgG(scFab-Fc), (Fv)2-Fc, 및 mAb-Fv으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 이중특이성 항체
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청구항 22에 있어서, 상기 scFv-Fc는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 또는 C-말단에 항원 특이성이 다른 2종의 항체 절편 scFv가 융합된 것인, 이중특이성 항체
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청구항 22에 있어서, 상기 scIgG(scFab-Fc)는 2종의 scFab가 융합된 것인, 이중특이성 항체
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청구항 22에 있어서, 상기 (Fv)2-Fc는 항원 결합 Fv를 이루는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL) 쌍의 2종이 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 및 C-말단에 각각 융합된 것인, 이중특이성 항체
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청구항 22에 있어서, 상기 mAb-Fv는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍으로 이루어진 IgG의 중쇄 C-말단에 가변 단일 항원 결합도메인 (VH 또는 VL)이 각각 융합된 이중특이성 가변 부위 융합 단일 항체의 형태인 것인, 이중특이성 항체
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청구항 20의 이종이중체 중쇄불변부위 쌍을 포함하는 1가 항원 결합 항체로서, 상기 항체는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 또는 C-말단에 단일 항원에 결합하는 중쇄가변부위 (VH) 및 경쇄가변부위 (VL)을 융합하여 단일 항원에 1가(monovalent)로 결합할 수 있는 Fv-Fc 형태인 것인, 항체
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청구항 20의 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 또는 C-말단에 2종의 단백질이 융합된 융합 단백질
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