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아미노 말단을 동의코돈으로 치환한 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법(Method for producing itaconic acid using CadA gene substituted with synonymous codon of N-terminal region)

  • 기술번호 : KST2017008458
  • 담당센터 : 대전기술혁신센터
  • 전화번호 : 042-610-2279
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 동의코돈으로 치환된 CadA(cis-aconitate decarboxylase) 유전자를 이용하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다. 상세하게는 동의 코돈 치환과 엠체리(mCherry) 접힘 리포터를 이용하여 CadA의 가용성 발현이 증대된 변이체를 선별하고, 선별된 상기 변이체를 갖는 대장균 숙주를 이용하여 0.5% 포도당이 첨가된 LB 배지에서 배양함으로써, 동일 조건으로 생산한 야생형 CadA를 포함하는 숙주보다 3배 높은 양의 이타콘산을 생산하였으며, 이후, 1%(v/v) 글리세롤(glycerol) 및 0.85g/ℓ의 구연산염(citrate)이 첨가된 변형된 M9 배지에서 0.2mM IPTG로 유도한 후 72시간 동안 배양하여 985.6±33.4㎎/ℓ의 이타콘산을 생산하였다. 또한, 동일한 배지를 이용한 유가 배양식 발효(fed batch fermentation)법으로 질소제한(nitrogen limitation)을 유도함으로써 이타콘산의 생산량을 약 7배(7.23g/ℓ)까지 증가시킬수 있다는 것을 확인하였다.
Int. CL C12P 7/44 (2016.01.05) C12N 9/88 (2016.01.05) C12N 15/70 (2016.01.05)
CPC C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01) C12P 7/44(2013.01)
출원번호/일자 1020150165746 (2015.11.25)
출원인 한국생명공학연구원
등록번호/일자
공개번호/일자 10-2017-0060952 (2017.06.02) 문서열기
공고번호/일자 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2015.11.25)
심사청구항수 7

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 최종현 대한민국 대전광역시 유성구
2 송재준 대한민국 대전광역시 유성구
3 정대은 대한민국 대전광역시 유성구
4 전호근 대한민국 대전광역시 유성구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 최규환 대한민국 대전광역시 서구 한밭대로 ***, **층 그린국제특허법률사무소 (둔산동)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국생명공학연구원 대전광역시 유성구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2015.11.25 수리 (Accepted) 1-1-2015-1152303-49
2 선행기술조사의뢰서
Request for Prior Art Search		 2016.09.20 수리 (Accepted) 9-1-9999-9999999-89
3 선행기술조사보고서
Report of Prior Art Search		 2016.11.10 수리 (Accepted) 9-1-2016-0047462-13
4 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2016.12.28 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0938803-37
5 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2017.02.21 수리 (Accepted) 1-1-2017-0178005-92
6 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2017.02.21 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2017-0178016-94
7 등록결정서
Decision to grant		 2017.06.21 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2017-0430539-42
번호, 청구항의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 청구항 표입니다.
번호 청구항
1 1
(1) 개시코돈을 제외한 5' 말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여, 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동의코돈을 포함하는 CadA 유전자 라이브러리로부터 가용성 및 발현량이 증진된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 선별하는 단계;(2) 상기 선별된 CadA 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 대장균 세포를 형질전환시키는 단계; 및(3) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 동의코돈으로 치환된 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법
2 2
제1항에 있어서, 상기 CadA 유전자의 3' 말단의 코딩 영역에 RFP(Red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein) 및 GFP(Green fluorescent protein) 중에서 선택된 어느 하나의 폴딩 리포터를 코딩하는 유전자를 융합하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법
3 3
제1항에 있어서, 상기 단계(3)의 배양은(a) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 R/2 또는 M9 최소배지에서 pH를 유지하기 위하여, 주기적으로 암모니아 용액을 공급하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양을 수행하는 단계; 및(b) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도하고, 상기 pH 조절을 위한 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)을 유도하는 2차 유가 배양을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법
4 4
제3항에 있어서, 상기 단계(a) 및 (b)에서 1차 및 2차 유가 배양은 25~40℃, 200~1000rpm의 조건으로 수행하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법
5 5
제3항에 있어서, 상기 단계(b)에서 질소제한은 세포의 성장을 정지시키는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법
6 6
삭제
7 7
(1) 시스-아코니테이트 디카르복실라아제(CadA)를 코딩하는 동의코돈 유전자 및 상기 유전자의 3' 말단에 엠체리(mcherry) 폴딩 리포터를 융합한 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;(2) 상기 유전자 라이브러리를 대장균에 형질전환하고, 가용성 및 발현량이 증진된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 선별하는 단계;(3) 상기 선별된 CadA 유전자가 도입된 대장균을 R/2 또는 M9 최소배지에서 주기적으로 암모니아 용액을 공급하여 pH를 유지하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양 단계; 및(4) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도(induction)하고, pH 조절을 위해 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)하는 2차 유가 배양 단계를 포함하는 이타콘산의 생산방법
8 8
삭제
9 9
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 유효성분으로 함유하는 대장균에서 이타콘산을 생산하기 위한 조성물
지정국 정보가 없습니다
패밀리정보가 없습니다
순번, 연구부처, 주관기관, 연구사업, 연구과제의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 국가R&D 연구정보 정보 표입니다.
순번 연구부처 주관기관 연구사업 연구과제
1 교육과학기술부 한국생명공학연구원 원천기술개발사업(글로벌프론티어) 항균 및 항바이러스 바이오소재 개발 연구
2 미래창조과학부 한국생명공학연구원 주요사업(2015-2018) 바이오화학 혁신기술 및 실증시스템 개발사업