1 |
1
제1 효소-링커와 제2 효소-링커의 결합체를 포함하는 다중 효소 결합체로서;상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고,상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산(non-natural amino acids, NNAAs)을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기가 제1 클릭 반응하여 결합된 결합체이며;상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고,상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 제2 효소-링커는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기가 제3 클릭 반응하여 결합된 결합체이며;상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커의 결합체는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기가 제2 클릭 반응하여 결합된 결합체인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
2 |
2
제1항에 있어서, 제1 효소 반응과 제2 효소 반응을 포함하고 상기 제1 효소 반응의 생성물이 상기 제2 효소 반응의 반응물로 사용되는 다중 효소 연쇄단계 반응에서, 상기 제1 효소는 상기 제1 효소 반응의 생촉매로 작용하고, 상기 제2 효소는 상기 제2 효소 반응의 생촉매로 작용하는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
3 |
3
제1항에 있어서, 상기 제1 효소와 상기 제2 효소는 각각 FDH와 MDH, MDH와 FDH; FDH와 ADH, ADH와 FDH; NOX와 ADH, ADH와 NOX; LDH와 HSDH, HSDH와 LDH; GDM와 7β-HSDH, 7β-HSDH와 GDM; ADH와 할로히드린 디할로제나제, 할로히드린 디할로제나제와 ADH; GDH와 케토리덕타제, 케토리억타제와 GDH; BVMO와 ADH, ADH와 BVMO; LDH와 AlaDH, AlaDH와 LDH; FDH와 PheDH, PheDH와 FDH; NOX와 LeuDH, LeuDH와 NOX; FDH와 LeuDH, LeuDH와 FDH; GOT와 TA, TA와 GOT; FDH와 AlaDH, AlaDH와 FDH; FDH와 GluDH, GluDH와 FDH 중에서 선택된 1쌍인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
4 |
4
제1항에 있어서, 상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 페닐알라닌, 트립토판, 발린 중에서 선택된 1종 이상의 소수성 측쇄를 포함하는 잔기인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
5 |
5
제1항에 있어서, 상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 용매 접근도가 0
|
6 |
6
제1항에 있어서, 상기 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산과 상기 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산은 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 p-아지도-L-페닐알라닌(AzF), p-에티닐-페닐알라닐(pEthF), p-프로파르길록시페닐알라닌(pPa) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
7 |
7
제1항에 있어서, 상기 제1 효소와 상기 제2 효소는 각각 FDH와 MDH이고,상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 각각 237번 위치의 발린과 417번 위치의 발린인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
8 |
8
제1항에 있어서, 상기 제2 클릭 반응은 상기 제1 클릭 반응과도 서로 직교성(orthogonal) 화학 반응이고, 상기 제3 클릭 반응과도 서로 직교성 화학 반응인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
9 |
9
제1항에 있어서, 상기 제1 클릭 반응과 상기 제2 클릭 반응은 각각 SPAAC와 IEDDA, IEDDA와 SPAAC; SPAAC와 카르보닐 리게이션, 카르보닐 리게인션과 SPAAC; IEDDA와 카르보닐 리게이션, 카르보닐 리게이션과 IEDDA; 카르보닐 리게인션과 광활성 리게이션, 광활성 리게이션과 카르보닐 리게이션 중에서 선택된 1쌍인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
10 |
10
제9항에 있어서, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 아지도기(N3)와 스트레인 프로모티드된(strain-promoted) 알킨기(C≡C), 스트레인 프로모티드된 알킨기와 아지도기; 아지도기와 알킨기, 알킨기와 아지도기; 테트라진기와 trans-시클로옥텐, trans-시클로옥텐과 테트라진기; 알데하이드와 아미노옥시, 아미노옥시와 알데하이드; 알데하이드와 하이드라진, 하이드라진과 알데하이드; 케톤과 아미노옥시, 아미노옥시와 케톤; 케톤과 하이드라진, 하이드라진과 케톤; 테트라졸과 알킨기, 알킨기와 테트라졸 중에서 선택된 1쌍이고;상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 아지도기(N3)와 스트레인 프로모티드된(strain-promoted) 알킨기(C≡C), 스트레인 프로모티드된 알킨기와 아지도기; 아지도기와 알킨기, 알킨기와 아지도기; 테트라진기와 trans-시클로옥텐, trans-시클로옥텐과 테트라진기; 알데하이드와 아미노옥시, 아미노옥시와 알데하이드; 알데하이드와 하이드라진, 하이드라진과 알데하이드; 케톤과 아미노옥시, 아미노옥시와 케톤; 케톤과 하이드라진, 하이드라진과 케톤; 테트라졸과 알킨기, 알킨기와 테트라졸 중에서 선택된 1쌍이며;상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 아지도기(N3)와 스트레인 프로모티드된(strain-promoted) 알킨기(C≡C), 스트레인 프로모티드된 알킨기와 아지도기; 아지도기와 알킨기, 알킨기와 아지도기; 테트라진기와 trans-시클로옥텐, trans-시클로옥텐과 테트라진기; 알데하이드와 아미노옥시, 아미노옥시와 알데하이드; 알데하이드와 하이드라진, 하이드라진과 알데하이드; 케톤과 아미노옥시, 아미노옥시와 케톤; 케톤과 하이드라진, 하이드라진과 케톤; 테트라졸과 알킨기, 알킨기와 테트라졸 중에서 선택된 1쌍인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
11 |
11
제1항에 있어서, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐이거나 trans-시클로옥텐 및 테트라진기이고;상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐이거나 trans-시클로옥텐 및 테트라진기이며;상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C)이거나 알킨기 및 아지도기인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
12 |
12
제1항에 있어서, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C) (또는 알킨기 및 아지도기)이고;상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C) (또는 알킨기 및 아지도기)이며;상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐 (trans-시클로옥텐 및 테트라진기)인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
13 |
13
제1항에 있어서, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기이고;상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 알킨기 및 아지도기이며;상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
14 |
14
제1항에 있어서, 상기 제1 개질 효소는 FDH-AzF이고,상기 제1 링커는 양 말단이 DBCO와 테트라진이며,상기 제2 링커는 양 말단이 DBCO와 TCO이고,상기 제2 개질 효소는 MDH-AzF인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
15 |
15
제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 하기 구조의 화합물이고,상기 제2 링커는 하기 구조의 화합물인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
16 |
16
제1항에 있어서, 상기 다중 효소 결합체는 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체
|
17 |
17
(C) 제1 효소-링커와 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서;상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고,상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기가 제1 클릭 반응하여 결합된 결합체이며;상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고,상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 제2 효소-링커는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기가 제3 클릭 반응하여 결합된 결합체이며;상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법
|
18 |
18
(B1) 제1 개질 효소와 제1 링크를 결합시켜 제1 효소-링크를 수득하는 단계,(B2) 제2 개질 효소와 제2 링크를 결합시켜 제2 효소-링크를 수득하는 단계,(C) 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서;상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 (B1) 단계는 상기 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기를 제1 클릭 반응시킴으로써 수행되며;상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며,상기 (B2) 단계는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기를 제3 클릭 반응시켜 수행되며;상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법
|
19 |
19
(A1) 제1 효소의 하나 이상의 제1 효소 잔기를 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산으로 위치 특이적으로 대체하여 제1 개질 효소를 수득하는 단계,(A2) 제2 효소의 하나 이상의 제2 효소 잔기를 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산으로 위치 특이적으로 대체하여 제2 개질 효소를 수득하는 단계,(B1) 상기 제1 개질 효소와 제1 링크를 결합시켜 제1 효소-링크를 수득하는 단계,(B2) 상기 제2 개질 효소와 제2 링크를 결합시켜 제2 효소-링크를 수득하는 단계,(C) 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서;상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 (B1) 단계는 상기 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기를 제1 클릭 반응시킴으로써 수행되며;상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고,상기 (B2) 단계는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기를 제3 클릭 반응시켜 수행되며;상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법
|
20 |
20
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다중 효소 결합체를 이용하여 다중 효소 연쇄단계(cascade) 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유기물 합성방법으로서,상기 다중 효소 연쇄단계 반응은 제1 효소 반응과 제2 효소 반응을 포함하고,상기 제1 효소 반응의 생성물이 상기 제2 효소 반응의 반응물로 사용되며,상기 다중 효소 결합체의 상기 제1 효소는 상기 제1 효소 반응의 생촉매로 작용하고,상기 다중 효소 결합체의 상기 제2 효소는 상기 제2 효소 반응의 생촉매로 작용하는 것을 특징으로 하는 유기물 합성방법
|
21 |
21
제20항에 있어서, 상기 제1 효소 반응과 상기 제2 효소 반응은 하기 반응 쌍 중에서 선택된 1쌍의 반응인 것을 특징으로 하는 유기물 합성방법:[반응식 1a][반응식 1b][반응식 1c][반응식 1d][반응식 1e][반응식 1f][반응식 1g][반응식 1h][반응식 1i][반응식 1j][반응식 1k][반응식 1l][반응식 1m][반응식 1n][반응식 1o][반응식 1p]
|
22 |
22
제21항에 있어서, 상기 제1 효소 반응은 하기 반응이고,상기 제2 효소 반응은 하기 반응이며,상기 유기물은 D-만니톨인 것을 특징으로 하는 유기물 제조방법
|