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수크라아제-이소말타아제(Sucrase-Isomaltase; SI) 복합체에 대한 모노클로날 항체를 CNBr 레진에 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 SI 복합체 효소 단백질 정제용 면역 친화성 크로마토그래피(Immuno-Affinity Chromatography; IAC) 칼럼의 제조 방법
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제1항에 있어서, 상기 SI 복합체에 대한 모노클로날 항체는 N-말단의 120개의 아미노산이 제거되고 폴리히스티딘 정제 태그(tag)가 도입된 수크라아제 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 대장균으로부터 생산되는 수크라아제를 면역원으로 이용하고, 하기의 단계를 통하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법(a) 대장균 균체를 초음파 파쇄하고 원심분리하여 얻은 비용해성 분획을 우레아를 포함하는 완충용액에서 초음파 파쇄하여 수크라아제를 가용화시킨 다음, 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 수크라아제를 정제하는 단계; 및(b) 염화나트륨을 포함하는 Tris-HCl 용액에서 재접힘 반응을 유도하여 수크라아제를 활성화하는 단계
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제1항에 있어서, 상기 SI 복합체에 대한 모노클로날 항체를 CNBr 레진에 결합시키는 단계는 하기의 세부 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법1) 커플링 버퍼가 담긴 투석막 튜브에 SI 복합체에 대한 항체를 넣어 교반하여 투석하는 단계;2) CNBr을 시린지에 넣어 가라앉히는 단계;3) 단계 1)에서 투석한 시료를 단계 2)의 CNBr에 로딩하여 결합시키는 단계; 및4) 블로킹 후 세척하는 단계
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제1항에 있어서, 상기 IAC 칼럼은 포유류 소장 단백질 추출물로부터 SI 복합체 효소 단백질을 분리 및 정제하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법
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제4항에 있어서, 상기 포유류 소장 단백질 추출물은 래트 유래인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항 내지 제3항에서 선택된 어느 하나의 방법으로 제조된 SI 복합체 효소 단백질 정제용 IAC 칼럼
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제6항의 IAC 칼럼을 포함하는 SI 복합체 효소 단백질 정제용 키트
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(1) SI 복합체에 대한 모노클로날 항체를 CNBr 레진에 결합시켜 SI 복합체 효소 단백질 정제용 IAC 칼럼을 제조하는 단계;(2) 시료를 상기 IAC 칼럼에 로딩하는 단계;(3) 상기 IAC 칼럼을 세척하는 단계;(4) 상기 세척된 IAC 칼럼에서 SI 복합체를 포함하는 분획을 용출하는 단계;(5) 용출된 분획에 가용화 버퍼를 넣고 초음파 파쇄를 수행한 후 원심분리를 통하여 상등액을 회수하는 단계;(6) 회수된 상등액으로 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 정제된 SI 복합체 효소 단백질을 수득하는 단계;(7) 정제된 SI 복합체 효소 단백질의 재접힘 반응을 유도하는 단계; 및(8) 한외여과(ultrafiltration)를 통하여 재접힘 반응이 완료된 SI 복합체 효소 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 IAC 칼럼을 이용한 SI 복합체 효소 단백질의 정제 방법
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제8항에 있어서, 상기 시료는 포유류 소장 단백질 추출물인 것을 특징으로 하는 방법
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제9항에 있어서, 상기 포유류 소장 단백질 추출물은 래트 유래인 것을 특징으로 하는 방법
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제8항에 있어서, 상기 SI 복합체에 대한 모노클로날 항체는 N-말단의 120 개의 아미노산이 제거되고 폴리히스티딘 정제 태그(tag)가 도입된 수크라아제 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 대장균으로부터 생산되는 수크라아제를 면역원으로 이용하는 것을 특징으로 하고, 하기의 단계를 통하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법(a) 대장균 균체를 초음파 파쇄하고 원심분리하여 얻은 비용해성 분획을 우레아를 포함하는 완충용액에서 초음파 파쇄하여 수크라아제를 가용화시킨 다음, 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 수크라아제를 정제하는 단계; 및(b) 염화나트륨을 포함하는 Tris-HCl 용액에서 재접힘 반응을 유도하여 수크라아제를 활성화하는 단계
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제8항에 있어서, 상기 단계 (1)은 하기의 세부 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법1) 커플링 버퍼가 담긴 투석막 튜브에 SI 복합체에 대한 항체를 넣어 교반하여 투석하는 단계;2) CNBr을 시린지에 넣어 가라앉히는 단계;3) 단계 1)에서 투석한 시료를 단계 2)의 CNBr에 로딩하여 결합시키는 단계; 및4) 블로킹 후 세척하는 단계
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