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서열번호 10의 링커를 포함하는 Cas9 단백질이 상기 링커 내부에서 절단되어 생성된 두 개의 하프 도메인 중, (1) N-말단을 포함하는 제1 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제1 도메인을 발현하는 재조합 벡터 및 (2) C-말단을 포함하는 제2 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제2 도메인을 발현하는 재조합 벡터를 각각 분리된 세포 내에 도입하는 단계를 포함하고,상기 제1 도메인의 암호화 서열은 C-말단 암호화 부위에 스플라이싱 도너 (splicing donor)가 연결된 것이고, 상기 제2 도메인의 암호화 서열은 N-말단 암호화 부위에 스플라이싱 억셉터 (splicing acceptor)가 연결된 것이며,상기 Cas9 단백질은 상기 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어지는 것이고,상기 세포 내에서 상기 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어진 상기 Cas9 단백질의 온전한 형태가 생성되는 것을 특징으로 하는, 유전자 발현 조절 방법
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서열번호 10의 링커를 포함하는 Cas9 단백질이 상기 링커 내부에서 절단되어 생성된 두 개의 하프 도메인 중, (1) N-말단을 포함하는 제1 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제1 도메인을 발현하는 재조합 벡터 및 (2) C-말단을 포함하는 제2 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제2 도메인을 발현하는 재조합 벡터를 각각 분리된 세포 내에 도입하는 단계를 포함하고,상기 제1 도메인의 암호화 서열은 C-말단 암호화 부위에 스플라이싱 도너 (splicing donor)가 연결된 것이고, 상기 제2 도메인의 암호화 서열은 N-말단 암호화 부위에 스플라이싱 억셉터 (splicing acceptor)가 연결된 것이며,상기 Cas9 단백질은 상기 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어진 것이고,상기 세포 내에서 상기 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어진 상기 Cas9 단백질의 온전한 형태가 생성되는 것을 특징으로 하는, Cas9 단백질의 세포 내 제조 방법
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제1항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절은 유전체 교정, 유전자 발현 증가 또는 유전자 발현 감소인, 방법
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제3항에 있어서, 상기 유전체 교정은 유전자 낙인 (knock-in), 낙아웃 (knock-out), 유전체 상에 표적화된 돌연변이 도입, 또는 유전체 상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 야생형 Cas9, 불활성화된 Cas9 (dCas9), 또는 Cas9 니케이즈 (nickase) 인 것인, 방법
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제5항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas9은 dCas9에 FokI 뉴클레아제 도메인을 연결한 RFN (RNA-guided FokI Nuclease), 또는 dCas9에 전사활성인자 (transcription activator) 또는 억제자 도메인 (repressor domain)을 연결한 것인, 방법
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제5항에 있어서, 상기 Cas9 니케이즈는 D10A Cas9 또는 H840A Cas9인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua), 및 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유래인 것인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 또는 바이러스 벡터인 것인, 방법
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제9항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노부속바이러스 (adeno-associated virus) 벡터, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 도메인을 발현하는 재조합 벡터는 제1 도메인 암호화 서열의 3' 말단에 정지코돈을 추가로 포함하고, 상기 제2 도메인을 발현하는 재조합 벡터는 제2 도메인 암호화 서열의 5' 말단에 시작코돈을 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인은 각각 NLS (nuclear localization signal), HA-태그, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열에 의하여 암호화 되고, 제2 도메인은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열에 의하여 암호화되는 것인, 방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 세포 내에 도입하는 단계에서 서열 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 추가로 도입하는 방법
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제15항에 있어서, 상기 각각의 벡터, 가이드 RNA의 도입은 동시, 순차 또는 역순으로 수행되는 것인 방법
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서열번호 10의 링커를 포함하는 Cas9 단백질이 상기 링커 내부에서 절단되어 생성된 두 개의 하프 도메인 중, (1) N-말단을 포함하는 제1 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제1 도메인을 발현하는 재조합 벡터 및 (2) C-말단을 포함하는 제2 도메인의 암호화 서열을 포함하는, 제2 도메인을 발현하는 재조합 벡터를 포함하고,상기 제1 도메인의 암호화 서열은 C-말단 암호화 부위에 스플라이싱 도너 (splicing donor)가 연결된 것이고, 상기 제2 도메인의 암호화 서열은 N-말단 암호화 부위에 스플라이싱 억셉터 (splicing acceptor)가 연결된 것이며,상기 Cas9 단백질은 상기 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어진 것인,유전자 발현 조절용 조성물
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제17항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 또는 바이러스 벡터인 것인, 조성물
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제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노부속바이러스 (adeno-associated virus) 벡터, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물
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제17항에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열에 의하여 암호화 되고, 제2 도메인은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열에 의하여 암호화되는 것인, 조성물
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21
제17항에 있어서, 상기 조성물은 서열 특이적인 가이드 RNA를 추가로 포함하는 것인, 조성물
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제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유전자 발현 조절용 키트
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제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물이 도입된, 인간의 배아를 제외한 분리된 형질전환 세포
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제23항의 형질전환 세포의 배양액 또는 세포 용해물을 포함하는, 유전자 발현 조절용 조성물
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