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(i) 시티딘 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자, 및 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;(ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및(iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계를 포함하고,상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질이고, 상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 5개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 10% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것이고,시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,단계 (i)의 세포로부터 분리된 DNA는 유전체 DNA이고,단계 (ii)의 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱에 의하여 수행되는 것인,시티딘 디아미나제의 염기 교정 위치 확인 방법
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(i) 시티딘 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자, 및 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;(ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및(iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계를 포함하고,상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질이고,상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 5개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 10% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것이고,시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,단계 (i)의 세포로부터 분리된 DNA는 유전체 DNA이고,단계 (ii)의 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱에 의하여 수행되는 것인,시티딘 디아미나제의 비표적 위치 (off-target site) 확인 방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질의, (1) D10, H840, 또는 D10 및 H840;(2) D1135, R1335, 및 T1337로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는(3) 상기 (1) 및 (2)의 아미노산 잔기 모두가 야생형과 다른 아미노산으로 치환된 것인, 방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA, 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)인, 방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 시티딘 디아미나제는 APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like), AID (activation-induced cytidine deaminase), CDA (cytidine deaminase), 또는 이들이 조합인, 방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 융합단백질 형태, 시티딘 디아미나제 또는 이를 암호화하는 mRNA와, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 mRNA의 혼합물 형태, 또는 시티딘 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 각각 또는 함께 포함하는 플라스미드 형태로 사용되는 것인, 방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)를 사용하지 않고,상기 우라실-특이적 제거 시약은 우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG), 엔도뉴클레아제 VIII, 및 이들의 조합인,방법
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제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 10개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 20% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것인, 방법
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제3항에 있어서, 상기 단계 (iii) 이후에,(iv) 상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
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제12항에 있어서, 상기 비표적 위치는 다음 중 하나 이상에 해당하는 것인, 방법:DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 PAM 서열을 포함;DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 표적 위치의 서열과 15개 이하의 불일치 뉴클레오타이드를 포함; 및DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 하나 이상의 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환을 포함
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