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세포 라이브러리를 이용한 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법으로, 상기 세포 라이브러리는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포 집단으로, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포 집단은 서로 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 다른 카피 수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포로 구성되고,상기 올리고뉴클레오티드는 세포의 게놈 내에 삽입(integration)되어 있으며,상기 올리고뉴클레오티드는 가이드 RNA (guide RNA)를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하고, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합을 할 수 있고,상기 방법은 세포 라이브러리에 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 도입; 및세포 라이브러리로부터 수득된 DNA의 분석을 포함하는, RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 100 내지 200bp의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 PAM (protospacer adjacent motif) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제3항에 있어서,상기 PAM 서열은 표적 염기서열의 5’ 말단 또는 3’ 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 직접 반복 서열, 폴리 T 서열, 바코드 서열, 불변부 서열, 프로모터 서열, 및 스캐폴드 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제9항에 있어서,상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속 및 캄필로박터 (Campylobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유래인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제9항에 있어서,상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 파세이박터 (Candidatus Paceibacter), 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma) 속, 및 유박테리움 (Eubacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유래인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 세포 라이브러리에 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 도입은 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease) 단백질 또는 이를 코딩하는 염기서열의 도입인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 세포 라이브러리로부터 수득된 DNA의 분석은 딥 시퀀싱 (deep sequencing)을 이용한 분석인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 세포 라이브러리로부터 수득된 DNA의 분석은 올리고뉴클레오티드의 표적서열 내의 인델을 검출하기 위한 분석인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법
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제1항에 있어서,상기 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease)의 활성을 평가하는 방법:(i) RNA-가이드 뉴클레아제의 PAM 서열 인식;(ii) RNA-가이드 뉴클레아제의 표적 활성 (on-target activity); 및(iii) RNA-가이드 뉴클레아제의 비표적 활성 (off-target activity)
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가이드 RNA를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포로 구성된 세포 라이브러리로,상기 세포 라이브러리는 서로 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 다른 카피 수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세포로 구성되고,상기 올리고뉴클레오티드는 세포의 게놈 내에 삽입(integration)되어 있으며,상기 올리고뉴클레오티드에 포함되는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 염기서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합할 수 있고,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하며,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는, 세포 라이브러리
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제16항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 100 내지 200bp의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 세포 라이브러리
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제16항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 PAM (protospacer adjacent motif) 서열을 포함하며, 상기 PAM 서열은 표적 염기서열의 5’ 말단 또는 3’ 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 세포 라이브러리
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가이드 RNA를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터로,상기 올리고뉴클레오티드에 포함되는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 염기서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합할 수 있고,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하며,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는, 벡터
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제19항에 있어서,상기 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터
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제20항에 있어서,상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-Associated Virus) 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 벡터
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가이드 RNA를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 2종 이상 포함하는 벡터 라이브러리로,상기 올리고뉴클레오티드에 포함되는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 염기서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합할 수 있고,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하며,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는, 벡터 라리브러리
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가이드 RNA를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로,상기 올리고뉴클레오티드에 포함되는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 염기서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합할 수 있고,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하며,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는, 올리고뉴클레오티드
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가이드 RNA를 코딩하는 염기서열, 바코드 서열 및 표적 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 2종 이상 포함하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리로,상기 올리고뉴클레오티드에 포함되는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열은 동일 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 표적 염기서열에 대해 Cis-작용 (Cis-acting)하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열이며,상기 표적 염기서열은 상기 가이드 RNA와 상보적 결합할 수 있고,상기 바코드 서열은 가이드 RNA를 코딩하는 염기서열과 표적 서열 사이에 위치하며,상기 바코드 서열은 2 이상의 반복 뉴클레오티드인 AA, CC, TT 및 GG를 포함하지 않는, 올리고뉴클레오티드 라이브러리
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