| 요약 |
본 발명은 체세포복제를 위한 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법 및 그에 따른 동결해동난자에 관한 것이다. 본 발명은 개과 동물의 성숙난자를 채취하는 과정(1과정), 상기에서 채취한 난자를 유리화동결과정을 수행하되,(2과정) 혼합액, 평형용액, 유리화 용액을 준비하는 과정(2과정-1), 상기의 혼합액은 10~30% SSS(Serum Substitute Supplement) 100중량부에 mHTF (Modified HTF Medium-HEPES with Gentamicin ) 300~1000중량부를 혼합한 것이고, 상기한 평형용액은 6.5~8.5%(v/v) 에틸렌글리콜 (Ethylene glycol), 6.5~8.5%(v/v) 디메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide), 10~30% 덱스트란 혈청 보충제(Dextran Serum Supplement) 그리고 25~45㎍/ml 젠타마이신 황산염(gentamicin sulfate)를 포함하는 HEPES 완충용액으로 구성되고, 상기한 유리화용액(Vitrification Solution)은 5~25%(v/v) 에틸렌글리콜 (Ethylene glycol), 5~25%(v/v) 디메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide), 10~30% 덱스트란 혈청 보충제(Dextran Serum Supplement) 25~45㎍/ml, 0.3~0.6M 수크로즈(Sucrose), 25~45㎍/ml 젠타마이신 황산염 gentamicin sulfate을 포함하는 HEPES 완충용액으로 구성되고, 상기에서 회수한 난자를의 난구세포 제거과정을 거치는(denuding) 과정(2과정-2), 상기의 난구세포를 제거한 성숙된 난자를 실온으로 평형시킨 혼합액에 처리하는 과정(2과정-3), 상기의 난자가 포함되어 있는 혼합액에 평형용액을 추가하고 처리한 후 다시 평형용액을 더 추가하여 처리하는 과정(2과정-4), 상기의 처리를 거친 난자를 다시 평형용액으로 처리하는 과정(2과정-5), 처리한 난자를 유리화용액으로 옮겨 처리하는 과정(2과정-6), 난자를 난자 동결 도구에 올리고 유리화용액을 제거 후 바로 액체질소에 침지해서 보관하는 과정(2과정-7), 을 포함하는 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 유리화 동결난자에 대하여 융해하는 과정(3과정)을 수행하되, 해동용액, 희석용액, 세척용액, 회복배양액을 준비하는 과정을 수행하되(3과정-1), 해동용액(Thawing Solution(IrvineScientific, USA))은 0.5~1.5M 수크로즈(Sucrose), 10~30% 덱스트란 혈청 보충제(Dextran Serum Supplement) 그리고 25~45㎍/ml 젠타마이신 황산염(gentamicin sulfate)를 포함하는 HEPES 완충용액으로 구성되고, 희석용액 (Dilution Solution)은 0.3~0.7M 수크로즈(Sucrose), 10~30% Dextran Serum Supplement 그리고 25~45㎍/ml 젠타마이신 황산염(gentamicin sulfate)를 포함하는 HEPES 완충용액으로 구성되고, 회복배양액(Recovery medium)은 HEPES 완충용액, 피루브산나트륨(Sodium pyruvate), 젠타마이신 황산염(gentamicin sulfate), FBS(Fetal Bovine Serum)를 혼합한 것으로 구성되고, 융해용액(Thawing Solution)을 인큐베이터에서 35~40℃로 가온시키는 과정(3과정-2), 회복배양액(Recovery medium)을 인큐베이터에서 35~40℃로 기온시키는 과정(3과정-3), 액체질소에 보관된 난자 동결 도구(CryoTop)를 꺼내어 가온한 융해용액에 넣고 난자 동결 도구(CryoTop)에 부착되어있는 난자를 분리하여 처리하는 과정(3과정-4), 상기의 분리된 난자를 상온에 평형시킨 희석용액에 옮겨 처리하는 과정(3과정-5), 상기의 처리된 난자를 상온에 평형시킨 세척용액 2개에 옮겨 순차적으로 처리하는 과정(3과정-6), 상기한 과정 후 회복배양을 위해 상기의 전배양한 회복배양액에서 배양하는 과정(3과정-7), 을 포함하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기한 바와 같은 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법으로 형성된 동결해동난자를 제공한다.
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