| 1 |
1
체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하거나 역분화를 촉진하는 세포전환용 RNA 나노입자를 체세포 또는 성체줄기세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 세포전환용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 유도만능줄기세포를 생성하는 배양단계를 포함하며,상기 세포전환용 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 나노입자와; 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 나노입자와; 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 가지는 복합 RNA 나노입자;를 포함하고,상기 세포전환용 RNA 나노입자는 RNA로 이루어지며, 구의 형태를 가지고, 50 내지 200nm의 직경을 가지며,상기 전령 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와; 상기 플라스미드 DNA와 RNA 중합효소를 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 RNA 중합효소를 통해 상기 플라스미드 DNA를 롤링 서클 전사시켜 전사인자 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되고,상기 마이크로 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와; 상기 원형의 DNA와 RNA 중합효소를 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 RNA 중합효소를 통해 상기 원형의 DNA를 롤링 서클 전사시켜 반복되는 마이크로 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 마이크로 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 마이크로 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되며,상기 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 가지는 복합 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열인 si 상보 염기 서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제1원형의 DNA를 생성하는 제1원형DNA생성단계와; 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 상기 si 상보 염기 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제2원형의 DNA를 생성하는 제2원형DNA생성단계와; 상기 제1원형의 DNA, 제2원형의 DNA 및 RNA 중합효소를 포함하는 반응용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 통해 상기 제1원형의 DNA 및 제2원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사시켜, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 작은 간섭 RNA 염기서열을 가지는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 상기 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보 결합하여 엉기면서 자기조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되고,상기 전사인자는 Oct4, Sox2, cMyc, LMyc, Klf4 및 Lin28으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 마이크로 RNA는 miRNA 302a, miRNA 302b, miRNA 302c, miRNA 302d, miRNA 367 및 miRNA 369로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 작은 간섭 RNA는 p53 siRNA인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포의 제조방법
|
