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1) AAVS1 표적 위치의 왼쪽 상동성 암(Left Homology Arm; LHA) 단편 유전자, T 세포 수용체 β(T cell receptor β; TCRβ) 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 오른쪽 상동성 암(Right Homology Arm; RHA) 단편 유전자가 순서대로 이루어진 공통 컨스트럭트 1을 제작하는 단계;2) T 세포 수용체 α(T cell receptor α; TCRα) 불변 영역 단편 유전자 및 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자가 순서대로 이루어진 공통 컨스트럭트 2를 제작하는 단계; 및3) 상기 공통 컨스트럭트 1, TCRα 가변 영역 단편 유전자, 상기 공통 컨스트럭트 2 및 TCRβ 가변 영역 단편 유전자를 원 스텝(one step) 클로닝하는 단계를 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터는 AAVS1 표적 위치의 LHA 단편 유전자, TCRα 가변 영역 단편 유전자, TCRα 불변 영역 단편 유전자, 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자, TCRβ 가변 영역 단편 유전자, TCRβ 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 RHA 단편 유전자를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터는 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제3항에 있어서, 상기 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자는 퓨로마이신 저항성 유전자(puromycin resistance gene; PuroR) 또는 디하이드로폴레이트 환원효소 이중 돌연변이(dihydrofolate reductase double mutant; DHFRdm) 유전자인 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 AAVS1 표적 위치의 LHA 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 AAVS1 표적 위치의 RHA 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 TCRα 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 3으로 표시되고, 상기 TCRβ 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 TCRα 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 5로 표시되고, 상기 TCRβ 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자는 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 제조방법
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1) AAVS1 표적 위치의 왼쪽 상동성 암(Left Homology Arm; LHA) 단편 유전자, T 세포 수용체 β(T cell receptor β; TCRβ) 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 오른쪽 상동성 암(Right Homology Arm; RHA) 단편 유전자가 순서대로 이루어진 공통 컨스트럭트 1을 제작하는 단계;2) T 세포 수용체 α(T cell receptor α; TCRα) 불변 영역 단편 유전자 및 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자가 순서대로 이루어진 공통 컨스트럭트 2를 제작하는 단계; 3) 상기 공통 컨스트럭트 1, TCRα 가변 영역 단편 유전자, 상기 공통 컨스트럭트 2 및 TCRβ 가변 영역 단편 유전자를 원 스텝(one step) 클로닝하여 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터를 제조하는 단계;4) 상기 제조된 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 T 세포 내로 형질전달시키는 단계; 및5) 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법
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제11항에 있어서, 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계는 퓨로마이신(puromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)로 처리하여 선별하는 것을 특징으로 하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법
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제11항에 있어서, 상기 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA는 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법
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