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CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 체세포의 CASH-1(CRISPR/Cas9-accessible safe harbor-1) 위치에 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 삽입하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell) 제조방법에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 gRNA(guide RNA; 가이드 RNA) 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 전달수단을 함유하며, 상기 gRNA는 서열번호 1로 표시되는 gRNA 1 및 서열번호 2로 표시되는 gRNA 2인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 CASH-1은 체세포의 염색체 1의 188,083,272 위치인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 전달수단은 벡터, 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 복합체, 캐리어 및 엑소좀으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 전달수단인 방법
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제3항에 있어서, 상기 gRNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 동일 또는 상이한 전달수단에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법
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제3항에 있어서, 상기 gRNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 동일 또는 상이한 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법
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제3항에 있어서, 상기 벡터는 Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV), 및 Retroviral Vector (RV)로 구성된 군에서 선택되는 바이러스 벡터; 또는 바이러스 레플리콘을 포함하는 에피좀 벡터인 것을 특징으로 하는 방법
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제6항에 있어서, 상기 에피좀 벡터는 Simian virus 40 (SV40), bovine papilloma virus (BPV) 또는 Epstein-Barr nuclear antigen (EBV)의 복제원점 (Ori)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
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제3항에 있어서, 상기 벡터는 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 또는 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, C2c12 또는 C2c2 단백질인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 분리된 것 또는 재조합된 것을 특징으로 하는 방법
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제9항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 야생형 Cas9, 불활성화된 Cas9(dCas9) 또는 Cas9 니카아제(nickase)인 것을 특징으로 하는 방법
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제11항에 있어서, 상기 Cas9 니카아제(nickase)는 SpnCas9(SpCas9-derived nickase)인 것을 특징으로 하는 방법
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제3항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산은 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여 삽입하는 것을 특징으로 하는 방법
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제13항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비(非)-바바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 방법
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제14항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV), 및 Retroviral Vector (RV)로 구성된 군에서 선택되는 벡터인 것을 특징으로 하는 방법
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제14항에 있어서, 상기 비(非)-바이러스성 벡터는 플라스미드 벡터 또는 에피솜 벡터인 것을 특징으로 하는 방법
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제16항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pUC57-Amp인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, SSEA4 및 TRA1-60로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 리프로그래밍 인자인 것을 특징으로 하는 방법
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제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2 및 KLF4로 구성된 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 독시사이클린(doxycycline)에 의해 발현이 제어되는 것을 특징으로 하는 방법
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제13항에 있어서, 상기 gRNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터의 몰비(molar ratio)는 1:1 내지 1:3인 것을 특징으로 하는 방법
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제21항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 선형(linear)인 것을 특징으로 하는 방법
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제1항에 있어서, 상기 체세포는 마우스 섬유아세포, 인간 섬유아세포(HDF), 인간 신장세포(HEK293T), 인간 각질세포(keratinocytes) 또는 인간 말초혈액세포인 것을 특징으로 하는 방법
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제23항에 있어서, 상기 체세포는 인간 섬유아세포(HDF) 또는 인간 신장세포(HEK293T)인 것을 특징으로 하는 방법
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