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서열번호 9 내지 11 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함하는 이중 RNA (dual guide RNA) 또는 sgRNA (single-chain guide RNA)인, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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2
제 1항에 있어서,상기 뉴클레오티드는, EEGFR 티로신 키나아제 도메인의 엑손 20에서 790번째 영역을 포함하는 서열에 특이적으로 결합하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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3
제 2항에 있어서,상기 EEGFR 티로신 키나아제 도메인의 엑손 20에서 790번째 영역을 포함하는 서열은,서열번호 5 또는 6 중 적어도 하나인, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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4
제 2항에 있어서,상기 EEGFR 티로신 키나아제 도메인의 엑손 20에서 790번째 영역을 포함하는 서열은,프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM)을 포함하고,상기 PAM은,5'-GGC-3', 5'-CGG-3' 및 5'-TGG-3' 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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5
제 3항에 있어서,상기 EEGFR 티로신 키나아제 도메인의 엑손 20에서 790번째 영역을 포함하는 서열은,상기 서열번호 5인 경우, 상기 서열번호 5에 대한 핵산 서열의 5'-말단으로부터 26번째 핵산이 사이토신(C)으로부터 티민(T)으로 변경된, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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6
제 1항에 있어서,상기 가이드 RNA는,3' 말단에 결합된 비오틴을 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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7
제 1항에 있어서,상기 가이드 RNA는,서열번호 7 또는 8의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 3 프라이머, 서열번호 12 또는 13의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 4 프라이머, 및 서열번호 14 또는 15의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 5 프라이머 중 적어도 하나에 의하여 합성되는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA
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8
제 1 항 내지 제 7 항 중 하나에 기재된 가이드 RNA를 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 유전자 분석 키트
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제 8항에 있어서,상기 키트는,서열번호 1 또는 2의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 2 프라이머를 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA를 포함하는 유전자 분석 키트
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10
제 8항에 있어서,상기 키트는,서열번호 3 또는 4의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 프라이머를 더 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA를 포함하는 유전자 분석 키트
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11
제 8항에 있어서,상기 키트는,서열번호 7 또는 8의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 3 프라이머, 서열번호 12 또는 13의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 4 프라이머 및 서열번호 14 또는 15의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제 5 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는, EGFR 돌연변이 진단용 가이드 RNA를 포함하는 유전자 분석 키트
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12
개체로부터 분리된 생물학적 시료 내에 포함되어 있는 cfDNA 중 표적 DNA를 포함하는 cfDNA를 제 1 증폭하는 단계;증폭된 상기 표적 DNA를 포함하는 cfDNA가 Cas9 단백질 및 가이드 RNA와 복합체를 형성하도록 혼합하는 단계;혼합된 상기 복합체로부터 표적 DNA를 포획(capture)하는 단계;상기 복합체에 포함되어 있는 상기 cas9 단백질을 변성시켜 포획된 상기 표적 DNA를 용출(elution)시키도록 상기 복합체를 가열하는 단계;용출된 상기 표적 DNA만을 포집하여 상기 표적 DNA를 농축(enrichement)시키는 단계, 및농축된 상기 표적 DNA를 제 2 증폭하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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13
제 12항에 있어서,상기 생물학적 시료는,혈액, 소변, 흉수, 분변, 객담, 복강액, 모유, 뇌척수액, 침, 림프액 및 기관 세척액으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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14
제 12항에 있어서,상기 증폭은, PCR에 의하여 수행되며, 상기 PCR은, 역전사(reverse transcription) 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스(multiplex) PCR, 실시간(real-time) PCR, 어셈블리(Assembly) PCR, 퓨전(Fusion) PCR, 리가아제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; LCR) 및 ddPCR(Droplet-digital PCR) 중 적어도 하나인, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 가이드 RNA는,폴리뉴클레오티드로 이루어진 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 이중 RNA (dual guide RNA) 또는 sgRNA (single-chain guide RNA)인, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 15항에 있어서,상기 가이드 RNA는,3' 말단에 결합된 비오틴을 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 Cas9 단백질은,Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 적어도 하나인, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 혼합하는 단계는,상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA를 혼합하는 단계;혼합된 상기 Cas9 및 가이드 RNA에 증폭된 상기 cfDNA를 첨가하여 복합체(complex)를 형성하도록 혼합하는 단계, 및상기 복합체에 자성 비드 복합체를 첨가하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 18항에 있어서,상기 자성 비드 복합체는,아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 중 적어도 하나를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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20
제 18항에 있어서,상기 자성 비드 복합체는,상기 가이드 RNA의 3' 말단에 결합된 비오틴에 결합하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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21
제 12항에 있어서,상기 포획하는 단계는,마그네틱 솔팅(magnetic sorting) 또는 유세포 솔팅(flow cytometric sorting)에 의하여 수행되는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 가열은,60 내지 70 ℃에서 수행되는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 제 2 증폭하는 단계는,상기 증폭이 ddPCR에 의하여 수행될 경우,농축된 상기 표적 DNA를 희석(dilution)하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 23항에 있어서,상기 희석은,농축된 상기 표적 DNA를 PCR 반응 버퍼에 100배 이상 희석하여 수행되는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 12항에 있어서,상기 제 2 증폭하는 단계 이후,상기 표적 DNA의 발현 수준에 따라, 상기 표적 DNA의 포함 유무를 결정하는 단계를 더 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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제 25항에 있어서,상기 결정하는 단계는,상기 증폭이 ddPCR에 의하여 수행되고, 상기 표적 DNA의 copy/reaction (ml) 값이 1 이상인 경우,상기 개체가 상기 표적 DNA를 포함한 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA를 이용한 유전자 분석 방법
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