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다음 단계를 포함하는, 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library) 구축 방법:(a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 짧은(shortened) crRNA를 합성하는 단계로서,상기 짧은 crRNA는, 5'-말단으로부터 7 내지 19로 이루어진 군에서 선택된 개수의 뉴클레오타이드로 이루어진 짧은(shortened) 표적인식서열(TRS, Target recognition sequence)을 포함하며; 및(b) 상기 짧은 crRNA를 합성하는 단계를 1회 이상 반복하여 짧은 crRNA를 포함하는 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리를 생성하는 단계
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제1항에 있어서,상기 짧은(shortened) 표적인식서열(TRS, Target recognition sequence)은 5'-말단으로부터 9개의 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는, 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library) 구축 방법
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제1항에 있어서,상기 상보적 결합은, 표적 DNA와 완전한 상보적 결합이거나 또는 하나 이상의 불일치(mismatch) 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library) 구축 방법
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제3항에 있어서,상기 표적 DNA는 상기 표적인식서열 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library) 구축 방법
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제1항에 있어서,상기 짧은 sgRNA는, 짧은(shortened) 표적인식서열(TRS, Target recognition sequence)을 포함하는 crRNA 및 trRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는, 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library) 구축 방법
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CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법:(a) DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas(dCas) 단백질이 과발현된 세포에, 제1항의 방법에 따라 제작된 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리(shortened sgRNA random library)를 도입시켜 형질전환시키는 단계를 포함하는 단계;(b) 상기 형질전환체 중 대조구와 비교하여 변형된 표현형을 나타내는 개체를 선별하는 단계; 및(c) 상기 선별된 개체에 도입된 짧은 sgRNA에 포함된 짧은 TRS 서열을 확인하여 높은 활성을 나타내는 표적 유전자를 스크리닝하는 단계
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제6항에 있어서,(d) 상기 (c) 단계의 스크리닝된 표적 유전자 중, 동일한 길이의 짧은 TRS를 포함하는 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리에서 중복되는 유전자 또는 다양한 길이의 짧은 TRS를 포함하는 짧은 sgRNA 랜덤 라이브러리들 사이에서 중복되는 유전자를 기준으로 표적 유전자를 추가 스크리닝하는 단계를 포함하는, CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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제6항에 있어서,상기 dCas 단백질은 데드 Cas9, 데드 Cas12a, 데드 Cas12b, 및 데드 Cas12c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 데드 CRISPR/Cas 효소인 것을 특징으로 하는, CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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제8항에 있어서,상기 dCas 단백질은 HNH 및 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 dCas9인 것을 특징으로 하는,CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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제9항에 있어서,상기 dCas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 것을 특징으로 하는,CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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제10항에 있어서,상기 dCas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) Cas9에 D10A, H840A 및 N863A로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는,CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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제6항에 있어서,상기 표적 유전자는 자일로즈 이화(xylose catabolism)에 관여하는 것을 특징으로 하는, CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference) 시스템 기반 표적 유전자 스크리닝 방법
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다음 단계를 포함하는, 목적 산물의 대량 생산 방법:⒜ 목적 산물을 생산하고자 하는 숙주세포에서, 제6항의 표적 유전자 스크리닝 방법에 따라 획득된 2 종 이상의 표적 유전자들을 결실시키는 단계; 및⒝ 상기 숙주세포를 배양하여 대량으로 생산된 목적 산물을 수득하는 단계
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