| 1 |
1
1) 폴리머성 겔 매트릭스 내에 고정화된 인산화 단백질의 인산화 위치를 표지 시약 혼합물을 사용하여 표지하는 단계;2) 표지된 단백질을 효소로 가수분해하여 가수분해된 펩티드를 얻는 단계; 및3) 상기 가수분해된 펩티드를 분석하는 단계로 구성되고,상기 표지 시약 혼합물은 설프히드릴(sulfhydryl) 관능기를 갖는 화합물로부터 선택된 표지 물질, 염기, 환원제 및 금속 촉매를 함유하는 것을 특징으로 하는 겔-내 표지된 단백질 분석을 통한 단백질 인산화 위치 동정방법
|
| 2 |
2
제 1항에 있어서, 상기 폴리머성 겔 매트릭스는 폴리아크릴아미드 겔임을 특징으로 하는 방법
|
| 3 |
3
제 2항에 있어서, 상기 폴리아크릴아미드 겔은 1 내지 30% 농도의 아크릴아미드를 함유하는 용액으로부터 제조되는 겔로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 4 |
4
삭제
|
| 5 |
5
제 1항에 있어서, 상기 염기는 무기염기임을 특징으로 하는 방법
|
| 6 |
6
제 1항에 있어서, 상기 염기는 유기염기임을 특징으로 하는 방법
|
| 7 |
7
삭제
|
| 8 |
8
제 1항에 있어서, 상기 설프히드릴(sulfhydryl) 관능기는 디설파이드(disulfide) 형태의 표지물질을 환원제로 환원함에 의해 제조됨을 특징으로 하는 방법
|
| 9 |
9
제 8항에 있어서, 상기 환원제는 트리스(2-시아노에틸)포스핀(TCNEP), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THPP), 트리부틸포스핀(TBP) 및 아릴디알킬포스핀(aryldialkylphosphine)으로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법
|
| 10 |
10
제 1항에 있어서, 상기 설프히드릴(sulfhydryl) 관능기는 표지 반응 단계 전에 염기성 가수분해 또는 친핵체 치환 방법으로 보호된 설프히드릴 기를 탈보호함에 의해 제조됨을 특징으로 하는 방법
|
| 11 |
11
제 1항에 있어서, 상기 표지 물질은 구아니디노알칸티올, 아미노알칸티올, 머캅토알칸올, 알칸티올, 알칸디티올, 디알킬아미노알칸티올 및 알콕시알칸티올로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법
|
| 12 |
12
제 1항에 있어서, 상기 표지 물질은 구아니디노알칸티올, 아미노알칸티올, 머캅토알칸올, 알칸티올, 알칸디티올, 디알킬아미노알칸티올 및 알콕시알칸티올로 구성되는 군에서 선택되고, 선택된 표지물질을 구성하는 적어도 하나 이상의 원자가 사실상 화학적 구조 및 반응성은 동일하고 단지 질량 값만 다른 동위원소로 치환된 (isotopically coded) 표지물질 동등체 임을 특징으로 하는 방법
|
| 13 |
13
제 1항에 있어서, 상기 인산화 위치는 인산화 세린 또는 인산화 트레오닌에서 선택되는 하나 이상임을 특징으로 하는 방법
|
| 14 |
14
제 1항에 있어서, 상기 효소는 가수분해 효소 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법
|
| 15 |
15
제 1항에 있어서, 상기 효소는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C 및 엔도프로테이나제 Lys-C로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법
|
| 16 |
16
제 1항에 있어서, 상기 가수분해된 펩티드를 분석하는 단계는, 상기 가수분해된 펩티드를 크로마토그래피에 의하여 분리한 후, 또는 크로마토그래피에 의한 분리 과정 없이 질량분석기에 의하여 질량분석하는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 17 |
17
1) 폴리아크릴아미드 겔에 유지된 인산화 단백질로부터 인산기의 탈인산화를 유도하고, 수득된 단백질의 탈인산화된 아미노산 잔기를, 설프히드릴(sulfhydryl) 관능기를 갖는 화합물로부터 선택된 표지물질로 겔-내 표지를 수행하는 단계;2) 인산화 단백질의 겔-내 표지 반응에 사용된 시약들을 폴리아크릴아미드 겔로부터 표지된 단백질의 유출 없이 선택적으로 제거하는 단계;3) 표지물질로 표지된 단백질을 프로테아제로 겔-내 가수분해하여 펩티드 혼합물을 얻는 단계; 및4) 폴리아크릴아미드 겔부터 유출되는 가수분해된 펩티드 혼합물을 크로마토그래피로 분리하고 질량 분석하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 겔-내 표지된 단백질 분석을 통한 단백질 인산화 위치 동정방법
|
| 18 |
18
제 17항에 있어서, 상기 단백질로부터 인산기의 탈인산화는 염기성 수용액 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 19 |
19
제 17항에 있어서, 상기 폴리아크릴아미드 겔은 5 내지 20% 농도의 아크릴아미드를 함유하는 용액으로부터 제조되는 겔로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 20 |
20
제 17항에 있어서, 상기 표지 물질은 구아니디노에탄티올, 아미노에탄티올, 머캅토에탄올, 에탄디티올, 디메틸아미노에탄티올, 트리메틸암모늄에탄티올, 디에틸아미노에탄티올 및 에톡시에탄티올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
|
| 21 |
21
제 17항에 있어서, 상기 표지 물질은 구아니디노에탄티올, 아미노에탄티올, 머캅토에탄올, 에탄디티올, 디메틸아미노에탄티올, 트리메틸암모늄에탄티올, 디에틸아미노에탄티올 및 에톡시에탄티올로 구성되는 군으로부터 선택되고, 선택된 표지물질을 구성하는 적어도 하나 이상의 원자가 사실상 화학적 반응성은 동일하고 단지 질량 값만 다른 동위원소로 치환된 (isotopically coded) 표지물질 동등체임을 특징으로 하는 방법
|
| 22 |
22
제 17항에 있어서, 상기 표지 물질은 해당 표지 물질의 이황체(disulfide) 형태로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 방법
|
| 23 |
22
제 17항에 있어서, 상기 표지 물질은 해당 표지 물질의 이황체(disulfide) 형태로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 방법
|
