| 1 |
1
다음의 단계를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA)을 이용한 표적핵산 검출 방법:(a) 검체 시료로부터 제조된 단일 가닥 핵산을 준비하는 단계;(b) i) 양 말단에 배치되어 표적핵산 서열과 상보적으로 결합하는 표적핵산 결합 영역;ii) 프라이머 결합 영역; iii) 제한효소 결합 영역; 및iv) 바코드 생성 영역;을 포함하는 선형 템플레이트와 상기 단일 가닥 핵산을 결합시킨 후 라이게이션을 수행하여 환형 템플레이트-표적핵산 결합체를 형성하는 단계;(c) 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 및 상기 제한효소 결합 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 절단용 핵산의 존재하에 회전환 증폭을 수행하여 단일가닥의 증폭산물을 생성하되, 제한효소(restriction enzyme)를 처리하여 상기 단일가닥의 증폭산물과 상기 절단용 핵산이 상보적으로 결합된 영역을 절단하여 상기 바코드 생성 영역과 상보적인 서열을 갖는 바코드를 포함하는 제1 증폭산물 및 상기 표적핵산 서열을 포함하는 제2 증폭산물을 수득하는 단계; 및(d) 상기 제1 증폭산물의 바코드를 검출하여 상기 표적핵산 서열의 존재 여부를 판별하는 단계,여기서, 상기 단일 가닥 핵산이 상기 표적핵산 서열을 포함하는 경우에 상기 환형 템플레이트-표적핵산 결합체가 형성되고, 상기 바코드가 제조되는 것을 특징으로 함
|
| 2 |
2
제1항에 있어서, 상기 바코드는 표적핵산 별로 미리 정의된 임의의 염기서열이며, 표적 핵산과 상보적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 3 |
3
제1항에 있어서, 상기 제2 증폭산물이 상기 (a) 단계의 단일 가닥 핵산으로 제공되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 4 |
4
제1항에 있어서, 상기 표적핵산은 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 5 |
5
제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적핵산 별로 서로 다른 템플레이트의 바코드 생성 영역이 증폭되어 제조된 바코드를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 6 |
6
제1항에 있어서, 상기 템플레이트의 표적핵산 결합영역은 표적 핵산의 검출하고자 하는 지점이 리가아제에 의해 연결되도록 설계되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 7 |
7
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 단일 가닥 핵산은 비대칭 PCR(polymerase chain reaction)로 제조되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 8 |
8
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 단일 가닥 핵산은 검체 시료로부터 추출한 이중 가닥 DNA(deoxyribonucleic acid)를 변성(denature)시킨 다음, 한쪽 단일 가닥에만 상보적으로 결합하는 블로커 DNA를 결합시켜 단일 가닥 핵산으로 제조하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 9 |
9
제1항에 있어서, 상기 바코드를 검출하는 방법은 상기 바코드에 상보적인 프로브를 포함하는 표면 측정형 센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 10 |
10
제9항에 있어서, 상기 표면 측정형 센서는 형광, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR), 쿼츠 크리스탈 마이크로밸런스(Quartx Crystal Microbalance, QCM) 및 캔틸레버로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 11 |
11
제9항에 있어서, 상기 바코드에 상보적인 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid) 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 12 |
12
제9항에 있어서, 상기 표면 측정형 센서가 형광을 이용할 경우, 상기 바코드에 상보적인 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 13 |
13
제12항에 있어서, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 14 |
14
제12항에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), 탐라(TAMRA), 이클립스(Eclipse), DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 15 |
15
제1항에 있어서, 상기 템플레이트는 스페이서 영역 및 형광 프로브 결합영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 16 |
16
제1항에 있어서, 상기 템플레이트의 제한효소 결합영역이 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 17 |
17
제1항에 있어서, 상기 절단용 핵산은 5‘말단 및 3’말단에 상기 템플레이와 결합하지 않는 임의의 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 18 |
18
제1항에 있어서, 상기 절단용 핵산은 5‘말단 및 3’말단에 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 19 |
19
제18항에 있어서, 상기 핵산중합이 억제되는 작용기 또는 염기는 아민기(amine group), 인산기(phosphate group), 알킬기(alkyl group), 알케인-다이올(alkane-diol), 포스포로사이오에이트(phophorothioate), 바이오틴(biotin), 비염기성 링커(non-nucleotide linker), C3-18 스페이서(C3-18 spacer), 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(di-deoxynucleotide triphosphate, ddNTP), 역방향 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted deoxynucleotide triphosphate, inverted dNTP) 및 역방향 디-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(inverted di-deoxynucleotide triphosphate, inverted ddNTP)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법
|
| 20 |
20
(a) i) 양 말단에 배치되어 표적핵산 서열과 상보적으로 결합하는 표적핵산 결합 영역;ii) 프라이머 결합 영역; iii) 제한효소 결합 영역; 및iv) 바코드 생성 영역;을 포함하는 선형 템플레이트;(b) 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머; (c) 상기 제한효소 결합 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 절단용 핵산; (d) 제한효소(restriction enzyme); 및(e) 리가아제(ligase);를 포함하는 표적핵산 검출을 위한 회전환 증폭용 조성물
|
