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선별마커를 남기지 않고 미생물 염색체의 특정 부분을 제거하는데 사용되는 선형 DNA 단편으로서, 상기 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 C; 선별마커 제거시 동성 재조합에 관여하는 상동부위 B; 선별마커; 상기 선별마커 제거 여부의 확인인자로서 sacB 유전자 (SEQ ID NO: 6); 및 선별마커 제거를 위한 동성 재조합에 관여하는 I-SceI 제한 효소 절제 부위 (SEQ ID NO: 4)를 포함하여 이루어지며, 상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이고, 상동부위 C는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이며, 상기 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 500 bp 부위와 상동인 부위이며, 상동부위 A 및 상동부위 C는 양쪽 말단에 하나씩 위치하고, 그 내부에 상동부위 B, 선별마커, sacB 유전자 및 I-SceI 제한효소 절제부위가 위치하며, 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C 중에서 자신과 상동인 미생물 염색체 부위에 인접한 말단과 상동이 아닌 것에 인접하여 위치하는 것을 특징으로 하는, 선형 DNA 단편
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제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 클로람페니콜 저항 유전자(CmR, SEQ ID NO:5)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:1, 2 및 3의 서열을 갖는 선형 DNA 단편
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제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 카나마이신 저항 유전자(KmR, SEQ ID NO:16)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:17, 18 및 19의 서열을 갖는 선형 DNA 단편
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제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 테트라사이클린 저항 유전자(TcR, SEQ ID NO:27)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:28, 29 및 30의 서열을 갖는 선형 DNA 단편
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(1) 제1항에 따른 선형 DNA 단편을 제조하는 단계; (2) 상기 DNA 단편 상의 상동 부위 A와 상동부위 C 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체(replacement)시키는 단계; 및 (3) 상기 특정 염색체 부분이 대체된 미생물에 I-SceI 제한 효소 발현 벡터를 도입하고 I-SceI 제한효소를 발현시켜, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위 B 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 동성 재조합을 유발하여, 선별마커를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 약 500 bp와 상동인 부위이고, 상동부위 C는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이며, 상기 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 500 bp 부위와 상동인 부위인 것을 특징으로 하는, 선별마커를 남기지 않고 특정 염색체 부위가 제거된 미생물 변이주를 제조하는 방법
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제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가, CmR 유전자를 갖는 pSG76C 벡터를 두 개의 제한효소 KpnI과 BamHI으로 절단하고, 리가아제를 이용하여 상기 CmR 유전자를 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 I-SceI 제한효소 절제부위를 갖는 선상의 pST76K 벡터에 삽입하고, 이를 BamHI 제한효소로 한 번 더 절단한 후, 여기에 pDELTA 벡터를 BamHI 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자를 리가아제를 이용하여 삽입하여 pCSI 벡터(SEQ ID NO:7)를 제조하고, 특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:1 및 3)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:2)를 얻은 후, 상기 pSCI 벡터와 3 개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 pSCI 벡터의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법
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제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가, 제 6 항의 방법에 따라서 얻어진 선형 DNA 단편의 CmR 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 KmR 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 CmR 유전자가 KmR 유전자로 대체된 PCR 단편을 얻고, 특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:17 및 19)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:18)를 얻은 후, 상기 PCR 단편과 3개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 PCR 단편의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법
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제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가, 제 6 항의 방법에 따라서 얻어진 선형 DNA 단편의 CmR 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 TcR 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 TcR 유전자로 대체된 PCR 단편을 얻고, 특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:28 및 30)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:29)를 얻은 후, 상기 PCR 단편과 3 개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 PCR 단편의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법
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제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 (2) 단계와 제 (3) 단계를 반복하여 수행하는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 순차적으로 특정 유전자를 제거할 수 있는 방법
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제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 (2) 단계와 제 (3) 단계를 반복하여 수행하는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 순차적으로 특정 유전자를 제거할 수 있는 방법
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