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(1) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제; 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자; 또는 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드, (2) 가이드 RNA, 및 (3) 우라실-특이적 제거 시약을 포함하고,상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 것이고,상기 우라실-특이적 제거 시약은 우라실 DNA 글라이코실라제 및 엔도뉴클레아제 VIII을 포함하며,유전체 DNA에 이중가닥 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정(base editing)이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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제1항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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제2항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 아미노산 잔기 D10이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이가 도입된 것인, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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제1항에 있어서, 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 융합 단백질 형태이거나,상기 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자는 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자인, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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제1항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 아미노산 잔기 D10가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이와 아미노산 잔기 H840이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이가 모두 도입된 것이고, 상기 조성물은 DNA의 단일 가닥 부위를 특이적으로 절단하는 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는 것인, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)인, 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석용 조성물
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(i) (a) 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 또는 (b) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자, 또는 (c) 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드를 가이드 RNA와 함께 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 유전체 DNA에 접촉시키는 단계; (ii) 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계; 및(iii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계를 포함하고상기 단계 (i)에서 사용된 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 것이고,상기 단계 (ii)에서 사용된 우라실-특이적 제거 시약은 우라실 DNA 글라이코실라제 및 엔도뉴클레아제 VIII을 포함하며,상기 단계 (iii)의 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱에 의하여 수행되고,상기 단계들은 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것인,시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정(base editing)이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석 방법
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제8항에 있어서,(iv) 상기 분석에 의하여 수득된 핵산 서열 데이터에서 이중 가닥 절단 위치를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,상기 단계는 시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,상기 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석은 시토신 디아미나제의 염기 교정 위치 확인을 위한 것인, 방법
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제8항에 있어서,(iv) 상기 분석에 의하여 수득된 핵산 서열 데이터에서 이중 가닥 절단 위치를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,상기 단계는 시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,상기 시토신 디아미나제에 의하여 염기 교정이 도입된 유전체 DNA의 핵산 서열 분석은 시토신 디아미나제의 비표적 위치 (off-target site) 확인을 위한 것인, 방법
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제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인, 방법
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제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 아미노산 잔기 D10이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이가 도입된 것인, 방법
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제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 융합 단백질 형태이거나,상기 시토신 디아미나제 암호화 유전자 및 Cas9 단백질 암호화 유전자는 시토신 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자인, 방법
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제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 아미노산 잔기 D10가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이와 아미노산 잔기 H840이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이가 모두 도입된 것이고, 상기 단계 (ii) 이후에, DNA의 단일 가닥 부위를 특이적으로 절단하는 엔도뉴클레아제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는,방법
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제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)인, 방법
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제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단계 (iv)는 하기의 수식에 의하여 계산된 절단 점수가 0
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제16항에 있어서, 절단점수가 0
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제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단계 (iv)는 하기의 수식에 의하여 계산된 절단 점수가 2
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제10항에 있어서, 상기 단계 (iv) 이후에,상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
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제10항에 있어서, 상기 단계 (iv)에서 확인된 절단 위치는 수득한 염기서열 데이터를 정렬하여 5' 말단이 수직 정렬된 위치, 또는 5' 말단 플롯에서 이중 피크 패턴을 보이는 위치인 것인, 방법
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제20항에 있어서, 상기 정렬은 표준 염기서열 (reference genome)로 염기서열 데이터를 맵핑한 뒤, BWA/GATK 또는 ISAAC을 이용하여 수행되는 것인, 방법
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제20항에 있어서, 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand)에 해당하는 염기서열 데이터 (sequence read)가 각각 두 개 이상씩 수직으로 정렬되는 위치를 비표적 위치인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
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제20항에 있어서, 20 % 이상의 염기서열 데이터가 수직으로 정렬되고, 각각의 왓슨 가닥 및 크릭 가닥에서 동일한 5' 말단을 가진 염기서열 데이터의 수가 10 이상인 위치가 비표적 위치인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
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