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부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법

  • 기술번호 : KST2015114730
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요약 본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하며, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.
Int. CL C12N 1/21 (2010.10.04) C12N 15/52 (2010.10.04) C12P 7/16 (2010.10.04) C12R 1/15 (2010.10.04)
CPC C12N 1/20(2013.01) C12N 1/20(2013.01) C12N 1/20(2013.01) C12N 1/20(2013.01)
출원번호/일자 1020100087550 (2010.09.07)
출원인 지에스칼텍스 주식회사
등록번호/일자 10-1697368-0000 (2017.01.11)
공개번호/일자 10-2012-0025262 (2012.03.15) 문서열기
공고번호/일자 (20170117) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2014.12.22)
심사청구항수 32

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 지에스칼텍스 주식회사 대한민국 서울특별시 강남구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 이상엽 대한민국 대전광역시 유성구
2 최용준 대한민국 대전광역시 대덕구
3 박진환 대한민국 대전광역시 유성구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 특허법인(유한) 대아 대한민국 서울특별시 강남구 역삼로 ***, 한양빌딩*층(역삼동)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 지에스칼텍스 주식회사 대한민국 서울특별시 강남구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application
2010.09.07 수리 (Accepted) 1-1-2010-0581655-38
2 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information
2013.02.01 수리 (Accepted) 4-1-2013-5019983-17
3 [심사청구]심사청구(우선심사신청)서
[Request for Examination] Request for Examination (Request for Preferential Examination)
2014.12.22 수리 (Accepted) 1-1-2014-1245042-41
4 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information
2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5157993-01
5 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information
2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5157968-69
6 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information
2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5158129-58
7 [출원인변경]권리관계변경신고서
[Change of Applicant] Report on Change of Proprietary Status
2016.01.11 수리 (Accepted) 1-1-2016-0026242-96
8 보정요구서
Request for Amendment
2016.01.19 발송처리완료 (Completion of Transmission) 1-5-2016-0008632-60
9 [출원서등 보정]보정서
[Amendment to Patent Application, etc.] Amendment
2016.01.20 수리 (Accepted) 1-1-2016-0063808-39
10 보정요구서
Request for Amendment
2016.09.30 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0704577-36
11 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment
2016.10.31 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2016-1062924-83
12 등록결정서
Decision to grant
2016.11.30 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0862508-68
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번호 청구항
1 1
L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염(ketoisovalerate)의 생성능을 가지는 미생물에, 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴(isobutyryl)-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, 이소부티릴-CoA를 부티릴(butyryl)-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부틸알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
2 2
제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
3 3
제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
4 4
제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 2-케토이소발레르산염의 축적율을 향상시키기 위하여, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
5 5
제4항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(트레오닌 디하이드라타제를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-이소프로필말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-메틸-2-옥소부타노에이트 하이드록시메틸트랜스페라제를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(가지달린 체인 아미노산 아미노트랜스페라제를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
6 6
제4항에 있어서, 상기 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법: (a) lacI(lac 오페론 억제인자를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 I) 및 ilvBN(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 II) 오페론의 감쇠영역(attenuator)을 포함하는 원래의 프로모터를 강한 프로모터로 치환; 및 (d) 강한 프로모터를 포함하는 발현벡터의 도입
7 7
제6항에 있어서, 상기 강한 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터 및 trp 프로모터로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
8 8
제6항에 있어서, 상기 강한 프로모터를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
9 9
제1항에 있어서, 상기 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소는 이소부티릴-CoA 뮤타아제이며, 상기 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소는 부틸알데하이드 디하이드로게나제이고, 상기 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소는 부탄올 디하이드로게나제인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
10 10
제1항에 있어서, 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 메타노사르시나(Methanosarcina) 아세티보란스(acetivorans) 유래의 VorABC인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
11 11
제1항에 있어서, 상기 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 아버미틸리스(avermitilis) 유래의 icmAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
12 12
제1항에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 adhE인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
13 13
제1항에 있어서, 상기 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법
14 14
L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물에, 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
15 15
제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
16 16
제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
17 17
제14항에 있어서, 상기 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소는 이소부티릴-CoA 뮤타아제이고, 상기 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소는 부틸알데하이드 디하이드로게나제이고, 상기 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소는 부탄올 디하이드로게나제인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
18 18
제14항에 있어서, 상기 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 메타노사르시나 아세티보란스 유래의 VorABC인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
19 19
제14항에 있어서, 상기 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 유래의 icmAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
20 20
제14항에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 adhE인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
21 21
제14항에 있어서, 상기 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
22 22
L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물에, 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, 이소부티릴-CoA를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부틸알데하이드로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부틸알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
23 23
제22항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(트레오닌 디하이드라타제를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-이소프로필말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-메틸-2-옥소부타노에이트 하이드록시메틸트랜스페라제를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(가지달린 체인 아미노산 아미노트랜스페라제를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
24 24
제22항에 있어서, 상기 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물: (a) lacI(lac 오페론 억제인자를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 I) 및 ilvBN(아세토하이드록시산 신타아제 이소자임 II) 오페론의 감쇠영역을 포함하는 원래의 프로모터를 강한 프로모터로 치환; 및 (d) 강한 프로모터를 포함하는 발현벡터의 도입
25 25
제24항에 있어서, 상기 강한 프로모터를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물
26 26
제14항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법
27 27
제22항 또는 제24항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법
28 28
L-발린의 전구체인 2-케토이소발레르산염의 생성능을 가지는 미생물에, 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 2-케토이소발레르산염에서 이소부티릴-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물
29 29
제28항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-케토이소발레르산염에서 이소부티릴-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물
30 30
제28항 또는 제29항의 재조합 미생물을 배양하여 이소부티릴-CoA를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 이소부티릴-CoA를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-케토이소발레르산염에서 이소부티릴-CoA를 생산하는 방법
31 31
2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 알파 서브유닛), VorB(2-옥소이소발레르산염 페레독신 옥시도리덕타제) 및 VorC(2-케토이소발레르산염 페레독신 리덕타제, 감마 서브유닛)로 구성되는 VorABC 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물을 이용하여 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 방법
32 32
제31항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-케토이소발레르산염을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 방법
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순번 패밀리번호 국가코드 국가명 종류
1 WO2012033334 WO 세계지적재산권기구(WIPO) FAMILY
2 WO2012033334 WO 세계지적재산권기구(WIPO) FAMILY

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1 WO2012033334 WO 세계지적재산권기구(WIPO) DOCDBFAMILY
2 WO2012033334 WO 세계지적재산권기구(WIPO) DOCDBFAMILY
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