| 1 |
1
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함되고, 상기 3'LTR의 유전자 전장이 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV) 유래의 3'LTR 유전자로 치환된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 2 |
2
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계; 4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 3 |
3
1) 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고, 상기 단계 1)의 프로모터는 CAG, CMV, SRα 및 EF-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 4 |
4
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼록시다아제(peroxidase) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 5 |
5
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 단계 1)의 재조합 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 유래의 gag-pol 발현벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 숙주세포에 공형질전환(cotransfection)하여 제조하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 6 |
6
제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 293T 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 7 |
7
제 5항에 있어서, 상기 공형질전환은 리포펙타민 매개된 방법, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화 칼슘(CaCl2) 침전법, DEAE-덱스트란-매개된 방법, 폴리브렌-매개된 방법, 전기천공법(electroporation), 미세주입(microinjection), 리포좀 융합, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 바이오리스틱스(biolistics)를 사용하여 전달하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 8 |
8
삭제
|
| 9 |
9
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자에, 숙주세포에 대한 레트로바이러스 입자의 결합활성을 유도하는 물질인 폴리브렌(polybrene), 리포펙타민(lipofectamince) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)을 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 10 |
10
제 9항에 있어서, 상기 폴리브렌(polybrene)은 최종농도 60 ~ 100 ㎍/㎖로 처리하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 11 |
11
삭제
|
| 12 |
12
제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 재조합 아데노바이러스 벡터는 도 8에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 13 |
13
제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 아데노바이러스 생산 세포주는 293 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 14 |
14
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 15 |
15
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 배아는 배자기(embryonic day) 8 내지 12일의 배아인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 16 |
16
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 미세주입은 말단이 20° 내지 30°로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
| 17 |
17
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 5)의 리포터 단백질의 발현은 형질전환 동물을 살아있는 상태로 측정하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법
|
