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다음의 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법:(a) 정상 박테리아를 34℃ 이상에서 배양하거나, 항생제 선별마커에 대응하는 항생제가 없는 환경에서 배양할 경우, 소실되는 특성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계;(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 선별마커에 대응하는 항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및(d) 상기 2차 형질전환된 박테리아를 무항생제 배지에서 배양하여 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계
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다음의 단계를 포함하는 박테리아 변이주의 제조방법:(a) 정상 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계;(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제2항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계;(d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지에서 배양하되 34℃ 이상에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 포함하며 제n+1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제n+1항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제n벡터를 사용하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주를 무항생제 배지에서 배양하여 삽입된 효소발현벡터 및 제 n벡터를 제거하는 단계,여기서, 상기 효소발현벡터, 제1벡터 및 제n벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현함
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제1항에 있어서, 상기 (d)단계는 상기 (c) 단계의 2차 형질전환된 박테리아를 10℃ 내지 42℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계는 Tween-20, DL-트레오닌(Theronine) 이소니아지드(isoniazid) 및 글라이신(Glycine)이 함유된 배지에서 배양하여 제조하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 효소(recombinase)는 RecT, RecET, Bet, 및 λ Red로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 단계의 재조합 효소(recombinase) 및 Cas 단백질은 동일 또는 서로 다른 벡터에 의하여 발현되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)은 동일 또는 서로 다른 벡터에 의하여 발현되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 디옥시리보핵산 상태로 세포에 직접 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제10항에 있어서, 상기 둘 이상의 타겟 유전자는 상기 유전자의 서열에 각각 상보적으로 결합하는 (i) 둘 이상의 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 상기 유전자의 서열 중 하나에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하여 동시에 결실시키는 것을 특징으로 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소발현벡터 또는 제1벡터는 서로 다른 항생제 선별마커(selective marker)를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 Ncgl1221, gabT, gabPsnaA, argF, crtEb 및 hmuO로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 리보핵산 상태로 세포에 직접 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제2항에 있어서, 상기 제1항생제 및 상기 제2항생제는 서로 다른 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 하나 이상 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제1벡터에서 발현되는 가이드 RNA(guide RNA)는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법
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