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합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법(Method for Fine-Tuning Gene Expression Using Synthetic Regulatory Small RNA)

  • 기술번호 : KST2015229186
  • 담당센터 : 대전기술혁신센터
  • 전화번호 : 042-610-2279
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 원핵세포 내에서 합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표적유전자 발현을 미세하게 조절하기 위하여 sRNA 발현양 또는 sRNA와 Hfq의 결합력을 조절하여 표적유전자의 발현을 미세 조절할 수 있는 합성 조절 sRNA에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합성 조절 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 방법은 sRNA 발현양 조절 또는 sRNA와 Hfq의 결합력을 조절함으로써 표적 유전자의 발현 억제 정도를 미세조절 할 수 있으므로, 유전자 발현을 조절하는 합성 조절 sRNA를 통한 유전자 결실 과정 없이 다양한 균주에서 다양한 표적 유전자의 조합을 동시다발적으로 쉽고 빠르게 적용할 수 있어 균주별 대사 능력 측정 및 최적 균주 선정에 매우 적합하다. 또한, 유전자 발현 억제 표적유전자를 쉽고 빠르게 선정할 수 있고 이렇게 선정된 유전자를 원하는 정도만큼 발현시킬 수 있다는 장점이 있으므로, 다양한 대사산물의 효율적 생산을 위한 재조합 균주의 제작 및 효율적 생산방법 확립에 사용할 수 있는바 매우 유용하다.
Int. CL C12N 1/21 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01)
CPC C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01) C12N 15/70(2013.01)
출원번호/일자 1020140070868 (2014.06.11)
출원인 한국과학기술원
등록번호/일자
공개번호/일자 10-2015-0142304 (2015.12.22) 문서열기
공고번호/일자 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 등록
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2015.04.21)
심사청구항수 11

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국과학기술원 대한민국 대전광역시 유성구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 이상엽 대한민국 대전광역시 유성구
2 노민호 대한민국 대전광역시 유성구
3 유승민 대한민국 서울특별시 강서구

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 장제환 대한민국 서울특별시 강남구 언주로 ***, **층 (역삼동, 윤익빌딩)(*T국제특허법률사무소)
2 이처영 대한민국 서울특별시 강남구 언주로 ***, **층 (역삼동, 윤익빌딩)(*T국제특허법률사무소)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국과학기술원 대한민국 대전광역시 유성구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2014.06.11 수리 (Accepted) 1-1-2014-0545824-63
2 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5158129-58
3 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5157993-01
4 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2014.12.24 수리 (Accepted) 4-1-2014-5157968-69
5 [심사청구]심사청구(우선심사신청)서
[Request for Examination] Request for Examination (Request for Preferential Examination)		 2015.04.21 수리 (Accepted) 1-1-2015-0386867-19
6 선행기술조사의뢰서
Request for Prior Art Search		 2016.01.18 수리 (Accepted) 9-1-9999-9999999-89
7 선행기술조사보고서
Report of Prior Art Search		 2016.02.05 수리 (Accepted) 9-1-2016-0008347-12
8 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2016.04.20 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0287965-22
9 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2016.06.20 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2016-0594927-74
10 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2016.06.20 수리 (Accepted) 1-1-2016-0594926-28
11 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2016.10.24 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2016-0761286-25
12 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2016.12.01 수리 (Accepted) 1-1-2016-1180885-24
13 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2016.12.01 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2016-1180886-70
14 심사처리보류(연기)보고서
Report of Deferment (Postponement) of Processing of Examination		 2017.04.26 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-6-2017-0062154-69
15 등록결정서
Decision to grant		 2017.06.15 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2017-0415806-31
16 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2019.04.24 수리 (Accepted) 4-1-2019-5081392-49
17 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2020.05.15 수리 (Accepted) 4-1-2020-5108396-12
18 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2020.06.12 수리 (Accepted) 4-1-2020-5131486-63
번호, 청구항의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 청구항 표입니다.
번호 청구항
1 1
(a) 프로모터; (b) 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 코딩하는 핵산; (c) Sgrs의 sRNA 유래의 서열번호 91로 표시되는 Hfq 결합 부위(Hfq binding site)를 코딩하는 핵산의 돌연변이가 유발된sRNA 구조체(scaffold); 및 (d) 전사종결자를 포함하고, 상기 돌연변이가 유발된 sRNA 구조체는 서열번호 91로 표시되는 염기서열에서 (i) 1번 내지 4번의 UAUU 염기가 GAUU, UCUU, UACU, UAAU, UAUC, UAUA, GCCC, GCAC, GACC 또는 GAAC로 치환된 sRNA 구조체, (ii) 5번 내지 8번의 GGUG 염기가 GGAC, CCUG, 또는 CCUC로 치환된 sRNA 구조체, (iii) 5번 내지 8번의 GGUG 염기에 2개 내지 4개의 염기가 삽입된 sRNA 구조체, (iv) 10번 내지 13번 AAAA 염기 서열 중 하나 이상이 G, C, U 중 하나로 치환된 sRNA 구조체, 및 (v) 42번 내지 49번 UUUUUUUU서열 중 1개 내지 4개의 염기가 결실된 sRNA 구조체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터
2 2
삭제
3 3
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, 구성형 프로모터인 앤더슨 프로모터 집합(Anderson promoter collection) 또는 유도성 프로모터인 아라비노스 오페론 프로모터, 락토스 오페론 프로모터로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벡터
4 4
제1항에 있어서, 상기 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역은 10 내지 100bp인 것을 특징으로 하는 벡터
5 5
제1항에 있어서, 상기 표적유전자의 mRNA는 DsRed2(적색 형광 단백질; red fluorescence protein), luxR(luxR 계열 전자 조절자; luxR family transcriptional regulator), araC(아라비노스 오페론 조절인자; arabinose operon regulatory protein), kanR(카나마이신 내성 유전자; kanamycin resistance gene), tyrR(티로신 결합 전사 조절인자; DNA-binding transcriptional dual regulator, tyrosine-binding), ppc(포스포에놀피루브산 카르복실화효소; phosphoenolpyruvate carboxylase), csrA(탄소 저장 조절 단백질; carbon storage regulator), pgi(포도당-6-인산이성질화효소; glucose-6-phosphate isomerase), gltA(시트르산합성효소; citrate synthase), accA(아세틸 조효소A 카르복실기 전이효소 알파서브유닛; acetyl-CoA carboxyltransferase, alpha subunit), accB(비오틴-카르복실기 운반단백질; biotin-carboxyl carrier protein), accC(아세틸 조효소A 카르복실화효소; acetyl-CoA carboxylase), accD(아세틸 조효소A 카르복실기 전이효소 베타서브유닛; acetyl-CoA carboxyltransferase, beta-subunit), aceE(피루브산 탈수소효소 E1p 구성요소; pyruvate dehydrogenase E1p component), aceF(피루브산 탈수소효소; pyruvate dehydrogenase), ackA(아세트산 키나아제 A; acetate kinase A), adiY(아르기닌 탈탄산효소 제어인자; arginine decarboxylase regulator), argB(아세틸 글루타메이트 키나아제; acetylglutamate kinase), argC(N-아세틸글루타밀포스페이트 환원효소; N-acetylglutamylphosphate reductase), argG(아르기닌숙신산 합성효소; argininosuccinate synthase), argH(아르기닌숙신산 분해효소; argininosuccinate lyase), asnC(AsnC 전사 조절 단백질; AsnC transcriptional regulator), crp(CRP 전사 이중조절자; CRP transcriptional dual regulator), csiD(탄소결핍에 의해 유도되는 예측단백질; a predicted protein induced by carbon starvation), csiR (탄소결핍으로 유도된 조절자; carbon starvation induced regulator), cytR(시스티딘 조절자; cytidine regulator), dcuA(디카르복실레이트 운반체; dicarboxylate transporter), deoB(포스포펜토뮤타제; phosphopentomutase), deoC(데옥시리보스-인산 알돌라제; deoxyribose-phosphate aldolase), deoR(데옥시리보뉴클레오시드 조절자; deoxyribonucleoside regulator), fabH(베타-케토아실-ACP-합성효소 3; beta-ketoacyl-ACP synthases 3), fadD(지방 아실-조효소A 합성효소; fatty acyl-CoA synthase), fadR(지방산 대사 조절 단백질; fatty acid metabolism regulator protein), fbp(과당-1,6-이인산 가수분해효소; fructose-1,6-bisphosphatase), fnr(푸마르산염과 질산염 환원 조절 단백질; fumarate and nitrate reduction regulatory protein), fruR(과당 오페론 전사 억제제; fructose operon transcriptional repressor), ftsL(필수 세포 분열 단백질 FtsL; essential cell division protein FtsL), ftsQ(필수 세포 분열 단백질 FtsQ; essential cell division protein FtsQ), ftsW(필수 세포 분열 단백질 FtsW; essential cell division protein FtsW), ftsZ(필수 세포 분열 단백질 FtsZ; essential cell division protein FtsZ), fur(철분 섭취 조절자; ferric uptake regulator), gabD(숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소; succinate semialdehyde dehydrogenase), gabP(GABA 투과효소; GABA permease), gabT(GABA 아미노기 전이효소; GABA aminotransferase), gadA(글루타메이트 탈탄산효소 A 서브유닛; glutamate decarboxylase A subunit), gadB(글루타메이트 탈탄산효소 B 서브유닛; glutamate decarboxylase B subunit), gadC(GABA APC 운반체; GABA APC transporter), glcC(glc 오페론 전사 활성인자; glc operon transcriptional activator), glpK(글리세롤 키나아제; glycerol kinase), glpR(글리세롤-3-레귤론 억제제; 3-Glycerol-3-phosphate regulon repressor), glpX(과당 1,6-이인산가수분해효소 II; fructose 1,6-bisphosphatase II), gltA(시트르산 합성효소; citrate synthase), hfld(용원화 조절자; lysogenization regulator), ihfa(삽입숙주인자 알파; Integration host factor alpha), ihfb(삽입숙주인자 베타; Integration host factor beta), ilvB(아세토락테이트 합성효소 동질효소 1 라지서브유닛; acetolactate synthase isozyme 1 large subunit), ilvC(아세토하이드록시산 이성질체 환원효소; acetohydroxy acid isomeroreductase), ilvD(디히드록시산 탈수효소; dihydroxy acid dehydratase), ilvG_1(아세토락테이트 합성효소 II N-말단 절편; acetolactate synthase II, large subunit, N-ter fragment), ilvG_2(아세토락테이트 합성효소 II C-말단 절편; acetolactate synthase II, large subunit, C-ter fragment), ilvH(아세토락테이트 합성효소 동질효소 3 스몰서브유닛; acetolactate synthase isozyme 3 small subunit), ilvL(ilvGEDA 오페론 리더 펩타이드; ilvGEDA operon leader peptide), ilvM(아세토락테이트 합성효소 동질효소 2 스몰서브유닛; acetolactate synthase isozyme 2 small subunit), ilvN(아세토히드록시부타노에이트 합성효소 동질효소 2 스몰서브유닛; acetohydroxybutanoate synthase isozyme 2 small subunit), ilvX(예측 스몰 단백질; Predicted small protein), lexA(전사조절자 LexA; transcription regulator LexA), lpxC(UDP-3-O-아실-N-아세틸글루코사민 탈아세틸화효소; UDP-3-O-acyl-N-acetylglucosamine deacetylase), marA(다중 항생제 내성 단백질 MarA; multiple antibiotic resistance protein MarA), metJ(MetJ 전사억제인자; MetJ transcriptional repressor), modE(전사조절자 ModE; transcriptional regulator ModE), nadB(L-아스파르트산 산화효소; L-aspartate oxidase), narL(질산염/아질산염 반응조절자; nitrate/nitrite response regulator), pck(포스포에놀피루브산 카르복시키나아제; phosphoenolpyruvate carboxykinase), PdhR(피루브산 탈수소효소 복합체 조절자; pyruvate dehydrogenase complex regulator), phoP(전사조절단백질 PhoP; Transcriptional regulatory protein PhoP), pnuC(PnuC NMN 운반체; PnuC NMN transporter), ppsA(포스포에놀피루베이트 합성효소; phosphoenolpyruvate synthetase), pta(인산염 아세틸기전달효소; Phosphate acetyltransferase), purA(아데닐숙신산 합성효소; adenylosuccinate synthetase), purB(아데닐로숙신산리아제; adenylosuccinate lyase), purR(HTH-타입 전사억제인자 PurR; HTH-type transcriptional repressor PurR), puuE(4-아미노부티레이트 아미노기전이효소; 4-aminobutyrate aminotransferase), rbsA(리보스 임포트 ATP-결합 단백질 RbsA; ribose import ATP-binding protein Rbs), rbsB(리보스 임포트 ATP-결합 단백질 RbsB; ribose import ATP-binding protein RbsB), rbsD(리보스 피라나제; ribose pyranose), rbsK(리보키나아제; ribokinase), rbsR(리보스 오페론 억제자; ribose operon repressor), rcsB(전사조절 단백질 RcsB; transcriptional regulatory protein RcsB), rutR(HTH-타입 전사조절자 RutR; HTH-type transcriptional regulator RutR), serA(D-3-포스포글리세린산 탈수소효소; D-3-phosphoglycerate dehydrogenase), serC(3-포스포세린 아미노기전이효소; 3-phosphoserine aminotransferase), soxS(조절단백질 SoxS; regulatory protein SoxS), sroD(sroD 조절 스몰 sRNA; SroD small RNA), zwf(글루코스 6-인산-1-탈수소효소; glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase), asnA(아스파라긴 합성효소 A; asparagine synthetase A), asnB(아스파라긴 합성효소 B; asparagine synthetase B), carA(카르바모일 인산 합성효소 A; carbamoyl phosphate synthetase A), carB(카르바모일 인산 합성효소 B; carbamoyl phosphate synthetase B), ddlB(D-알라닌-D-알라닌 리가아제 B; D-alanine-D-alanine ligase B), deoA(티미딘 인산화효소; thymidine phosphorylase), deoD(퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 deoD-타입; purine nucleoside phosphorylase deoD-type), dpiA(전사조절 단백질 DpiA; transcriptional regulatory protein DpiA), fis(fis 관련 전사조절인자; Fis family transcriptional regulator), gadE(DNA 결합 전자 활성인자; DNA-binding transcriptional activator), gadW(전사 조절자 GadW; transcriptional regulator GadW), gadX(전사 조절자 GadX; transcriptional regulator GadX), glpF(글리세롤 섭취 촉진제 단백질; glycerol uptake facilitator protein), ilvY(IlvY DNA 결합 전사 이중조절자; IlvY DNA-binding transcriptional dual regulator), ivbL(ilvB 오페론 리더 펩타이드; ilvB operon leader peptide), lhgO (L-2-히드록시글루타레이트 산화효소; L-2-hydroxyglutarate oxidase), lpd(리포아미드 탈수소효소; Lipoamide dehydrogenase), lrp(Lrp 전사 이중조절자; Lrp transcriptional dual regulator), metB(O-숙시닐호모세린 리아제; O-succinylhomoserine lyase), metL(아스파르트산 인산화효소; aspartate kinase), mraY(포스포-N-아세틸무라모일-펜타펩티드 전이효소; phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide transferase), mraZ(전사조절자 MraZ; transcriptional regulator MraZ), murE(UDP-N-아세틸무라모일알라닐-D-글루타메이트 2,6-디아미노피멜레이트 리가아제; UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate 2,6-diaminopimelate ligase), murF(D-알라닐-D-알라닌 첨가효소; D-alanyl-D-alanine-adding enzyme), murG(N-아세틸글루코사민 전이효소; N-acetylglucosaminyl transferase), nac(질소 동화 조절 단백질; nitrogen assimilation regulatory protein), nadA(퀴놀리네이트 합성효소; quinolinate synthase), nsrR(아질산염-민감 전사 억제자; nitrite-sensitive transcriptional repressor), panC(판토텐산 합성효소; pantothenate synthetase), panD(아스파르트산염 1-탈카르복실화효소; Aspartate 1-decarboxylase), pgl(6-포스포글루코노락토나제; 6-phosphogluconolactonase), pyrB(아스파르트산염 카르바모일 전이효소 PyrB 서브유닛; aspartate carbamoyltransferase, PyrB subunit), pyrC(디하이드로오로타제; dihydroorotase), pyrL(아스파르트산염 카르바모일 전이효소 PyrI 서브유닛; aspartate carbamoyltransferase, PyrI subunit), rob(오른쪽 원점 결합단백질; right origin-binding protein), rpe(리불로오스-인산 3-에피머화효소; ribulose phosphate 3-epimerase), talA(알돌 전이효소 A; transaldolase A), thrA(호모세린 탈수소효소; homoserine dehydrogenase), thrB(호모세린 키나아제; homoserine kinase), thrC(트레오닌 합성효소; threonine synthase), thrL(thr 오페론 리더 펩티드; thr operon leader peptide), tktA(케톨 전이효소 I; transketolase I), tktB(케톨 전이효소 II; transketolase II) 및 torR(torCAD 오페론 반응조절자 TorR; torCAD operon response regulator TorR)로 구성되는 군에서 선택된 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 벡터
6 6
제1항에 있어서, 상기 sRNA 구조체는 돌연변이에 의해 Hfq와의 결합력이 조절되는 것을 특징으로 하는 벡터
7 7
제1항에 있어서, 상기 전사종결자는 U tail의 길이가 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 벡터
8 8
제1항의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물
9 9
제1항의 벡터를 원핵생물 내로 도입하거나 원핵생물 내에서 발현시켜, 표적유전자의 mRNA 발현을 조절하는 방법
10 10
제9항에 있어서, 상기 원핵생물은 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 멘하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법
11 11
다음의 단계를 포함하는 목적물질 생산을 위한 표적유전자의 스크리닝 방법: (a) 목적물질을 생산하고자 하는 대상 균주에서, 목적물질 생합성 경로에 관여하는 유전자들 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 제9항의 방법으로 조절하는 단계; 및 (b) 상기 발현 조절에 따라 목적물질 생산수율이 향상되는 경우, 발현을 조절시킨 유전자를 목적물질 생산을 위한 표적유전자로 선정하는 단계
12 12
다음의 단계를 포함하는 목적물질 생산균주의 개량방법: (a) 목적물질을 생산하고자 하는 대상 균주에서, 목적물질 생합성 경로에 관여하는 유전자들 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 제9항의 방법으로 조절하는 단계; 및 (b) 상기 발현 조절에 따라 목적물질 생산수율이 향상되는 경우, 발현을 조절시킨 유전자를 목적물질 생산을 위한 표적유전자로 스크리닝하는 단계; 및(c) 상기 스크리닝된 유전자를 도입하여 재조합 균주를 제조하는 단계
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1 미래창조과학부 한국과학기술원 글로벌프론티어연구개발사업 합성생물학 기반 페놀 및 방향족 바이오폴리머 생산 지능형 균주 개발