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ＨＩＦ-1 알파와 ｐ300 단백질과의 결합을 실시간 분석하는 방법

  • 기술번호 : KST2015122198
  • 담당센터 : 서울동부기술혁신센터
  • 전화번호 : 02-2155-3662
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요약, Int. CL, CPC, 출원번호/일자, 출원인, 등록번호/일자, 공개번호/일자, 공고번호/일자, 국제출원번호/일자, 국제공개번호/일자, 우선권정보, 법적상태, 심사진행상태, 심판사항, 구분, 원출원번호/일자, 관련 출원번호, 기술이전 희망, 심사청구여부/일자, 심사청구항수의 정보를 제공하는 이전대상기술 뷰 페이지 상세정보 > 서지정보 표입니다.
요약 본 발명은 형광 에너지 전달 (Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET) 방법을 이용하여 세포 내에서의 HIF-1α와 p300 단백질 간의 결합을 실시간으로 정량 분석하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 HIF-1α와 p300 단백질 결합 억제제 또는 촉진제를 실시간으로 세포내에서 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 형광 에너지를 전달해주는 공여체 (donor, 예컨대, ECFP)를 C-말단에 표지한 p300과 형광 에너지를 전달받는 수여체 (acceptor, 예컨대, EYFP)를 C-말단에 표지한 HIF-1α 간의 에너지 전달 효율로부터 두 단백질의 결합 정도를 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.
Int. CL C12N 15/12 (2006.01) G06F 17/10 (2006.01) C12N 15/79 (2006.01) G01N 33/52 (2006.01)
CPC G01N 33/6845(2013.01) G01N 33/6845(2013.01) G01N 33/6845(2013.01) G01N 33/6845(2013.01) G01N 33/6845(2013.01)
출원번호/일자 1020120005389 (2012.01.17)
출원인 한국과학기술연구원
등록번호/일자 10-1435605-0000 (2014.08.22)
공개번호/일자 10-2013-0084536 (2013.07.25) 문서열기
공고번호/일자 (20140828) 문서열기
국제출원번호/일자
국제공개번호/일자
우선권정보
법적상태 소멸
심사진행상태 수리
심판사항
구분 신규
원출원번호/일자
관련 출원번호
심사청구여부/일자 Y (2012.01.17)
심사청구항수 8

출원인

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번호 이름 국적 주소
1 한국과학기술연구원 대한민국 서울특별시 성북구

발명자

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번호 이름 국적 주소
1 양은경 대한민국 서울 서초구
2 김소연 대한민국 경기 과천시 별양로 **,

대리인

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번호 이름 국적 주소
1 유미특허법인 대한민국 서울특별시 강남구 테헤란로 ***, 서림빌딩 **층 (역삼동)

최종권리자

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번호 이름 국적 주소
1 한국과학기술연구원 서울특별시 성북구
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번호 서류명 접수/발송일자 처리상태 접수/발송번호
1 [특허출원]특허출원서
[Patent Application] Patent Application		 2012.01.17 수리 (Accepted) 1-1-2012-0044322-13
2 선행기술조사의뢰서
Request for Prior Art Search		 2012.11.07 수리 (Accepted) 9-1-9999-9999999-89
3 선행기술조사보고서
Report of Prior Art Search		 2012.12.17 수리 (Accepted) 9-1-2012-0092988-12
4 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2013.08.20 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2013-0573511-91
5 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2013.10.17 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2013-0938328-01
6 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2013.10.17 수리 (Accepted) 1-1-2013-0938313-16
7 의견제출통지서
Notification of reason for refusal		 2014.02.17 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2014-0113484-13
8 출원인정보변경(경정)신고서
Notification of change of applicant's information		 2014.02.19 수리 (Accepted) 4-1-2014-5022002-69
9 [거절이유 등 통지에 따른 의견]의견(답변, 소명)서
[Opinion according to the Notification of Reasons for Refusal] Written Opinion(Written Reply, Written Substantiation)		 2014.04.14 수리 (Accepted) 1-1-2014-0354326-13
10 [명세서등 보정]보정서
[Amendment to Description, etc.] Amendment		 2014.04.14 보정승인간주 (Regarded as an acceptance of amendment) 1-1-2014-0354327-58
11 등록결정서
Decision to grant		 2014.08.18 발송처리완료 (Completion of Transmission) 9-5-2014-0557715-67
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번호 청구항
1 1
1) N 말단, C 말단 또는 양 말단이 제1 형광 물질로 표지된 HIF-1α를 포함하는 HIF-1α 플라스미드를 준비하는 단계;2) N 말단, C 말단 또는 양 말단이 제2 형광 물질로 표지된 p300 단백질을 포함하는 p300 단백질 플라스미드를 준비하는 단계;3) 상기 준비된 HIF-1α 플라스미드 및 p300 단백질 플라스미드를 진핵세포 내로 주입하여 세포를 트랜스펙션시키는 단계; 및4) 상기 트랜스펙션된 세포에서 발생하는 형광을 측정하여 형광 전달 효율을 다음의 식에 의하여 산정하는 단계:를 포함하고,상기 제1 형광 물질과 제2 형광 물질 중 하나는 형광 에너지를 전달하는 형광 에너지 공여체(donor)이고 다른 하나는 형광 에너지를 전달 받는 형광 에너지 수여체(acceptor)이고, 이 때, 상기 형광 에너지 공여체의 형광 스펙트럼이 형광 에너지 수여체의 흡광 스펙트럼과 전부 또는 일부 중복되는 것인,HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법:[식]FRET index = IDA-(aDIDA)-(aAIDA)FRET efficiency = FRET index / 255상기 식 중, aD는 형광 에너지 공여체의 형광의 누수비율,aA는 형광 에너지 수여체 흡광에 의한 형광 비율, 및IDA는 형광 에너지 수여체와 형광 에너지 공여체가 동시에 발현된 세포내의 형광 에너지 공여체 여기 후 형광 에너지 수여체의 형광세기를 의미함
2 2
제1항에 있어서, 상기 산정하는 단계 4)에 따라 산정된 형광 전달 효율이 10 내지 20%인 경우 HIF-1α와 p300 단백질이 결합한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법
3 3
제1항에 있어서, 상기 HIF-1α는 서열번호 1의 아미노산 서열 중에서 786번째부터 826번째까지의 아미노산을 포함하여 연속하는 41 내지 826개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드이고,상기 p300 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 323번째부터 423번째까지의 아미노산을 포함하여 연속하는 101 내지 2414개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드인,HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법
4 4
제1항에 있어서, 상기 형광 에너지 공여체는 BFP(Blue Fluorescent Protein), ECFP(Cyan Fluorescent Protein), GFP(Green Fluorescent Protein), EYFP(Yellow Fluorescent Protein), 및 Orange-red로 이루어진 군에서 선택된 것이고,상기 형광 에너지 수여체는 ECFP(Cyan Fluorescent Protein), GFP(Green Fluorescent Protein), EYFP(Yellow Fluorescent Protein), RFP (Red fluorescent protein), 및 Far-red RFP로 이루어진 군에서 선택된 것인,HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법
5 5
제1항에 있어서,상기 형광 에너지 공여체와 형광 에너지 수여체는 각각 p300 단백질과 HIF-1α의 동일한 말단에 결합된 것인,HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법
6 6
제1항에 있어서, p300 단백질을 형광 에너지 공여체로, HIF-1α를 형광 에너지 수여체로 표지하는 것을 특징으로 하는,HIF-1α와 p300 단백질의 결합을 측정하는 방법
7 7
1) N 말단, C 말단 또는 양 말단이 제1 형광 물질로 표지된 HIF-1α와 N 말단, C 말단 또는 양 말단이 제2 형광 물질로 표지된 p300 단백질을 포함하는 세포를 준비하는 단계; 및2) 상기 세포에 후보 화합물을 접촉시키고 배양 후 형광 에너지 전달 효율을 측정하는 단계; 및3) 상기 후보 화합물 접촉된 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율을 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율과 비교하는 단계를 포함하고,상기 제1 형광 단백질과 제2 형광 단백질 중 하나는 형광 에너지를 전달하는 공여체(donor)이고 다른 하나는 형광 에너지를 전달 받는 수여체(acceptor)이고, 이 때, 상기 형광 에너지 공여체의 형광 스펙트럼이 형광 에너지 수여체의 흡광 스펙트럼과 전부 또는 일부 중복되는 것이며,상기 형광 에너지 전달 효율은 다음의 식에 의하여 측정되고,상기 후보 화합물 접촉된 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율보다 높은 경우, 상기 후보 화합물을 HIF-1α와 p300 단백질 간 결합 촉진제로 판단하고, 상기 후보 화합물 접촉된 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포에서 측정된 형광 에너지 전달 효율보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 HIF-1α와 p300 단백질 간 결합 억제제로 판단하는 것을 특징으로 하는,HIF-1α 펩타이드와 p300 단백질 간의 결합 조절제의 스크리닝 방법:[식]FRET index = IDA-(aDIDA)-(aAIDA)FRET efficiency = FRET index / 255상기 식 중, aD는 형광 에너지 공여체의 형광의 누수비율,aA는 형광 에너지 수여체 흡광에 의한 형광 비율, 및IDA는 형광 에너지 수여체와 형광 에너지 공여체가 동시에 발현된 세포내의 형광 에너지 공여체 여기 후 형광 에너지 수여체의 형광 파장을 의미함
8 8
제7항에 있어서, 상기 후보 화합물은 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 합성 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 스크리닝 방법
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10 10
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